Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Mục đích: sử dụng kết hợp các phương pháp cải tạo giống thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces 52.13 và tạo ra các biến chủng có HTKS mạnh.

- Mục đích: sử dụng kết hợp các phương pháp cải tạo giống thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces 52.13 và tạo ra các biến chủng có HTKS mạnh.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

23



ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha lỗng

đến 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng.

- Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ

10-1 đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách

60cm, thời gian 5 phút, sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vơ trùng pha

lỗng đến nồng độ 10-5 bằng nước vô trùng.

- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 0,1ml mẫu

chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa

Petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vơ trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử

trên bề mặt thạch, mỗi nồng độ làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được

ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc,

xác định % độ sống sót theo cơng thức:

% độ sống sót =



Nm

×10-6+k×100%

No



Trong đó: 10-k : nồng độ hỗn dịch bào tử sử dụng.

Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến

No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.

- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như

phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi

hoạt tính được xác định theo cơng thức:

% biến đổi hoạt tính =



Di

×100%

Do



Trong đó:

D i : Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB

D o : Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn của mẫu chứng.



- Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả để lựa chọn ra các biến chủng

có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.



24



2.3.3.3.Đột biến bằng phương pháp hóa học

- Pha hỗn dịch bào tử tương tự như phương pháp đột biến bằng tia UV

- Tiến hành đột biến bằng hóa chất :

Cho vào ống nghiệm chứa 9ml hỗn dịch bào tử 0,07 – 0,075g NaNO2, lắc

cho tan hết. Thêm HCl 1N vào đến pH = 4,5 rồi để yên 2 phút. Thêm tiếp NaOH

vào đến pH=7,5 rồi để yên 1 – 2 phút. Pha loãng đến nồng độ 10-4 , 10-5.

- Nuôi cấy sau ĐB tương tự như đột biến UV

- Đếm các khuẩn lạc, tính % độ sống sót và tiến hành sàng lọc với các

khuẩn lạc sau đột biến và thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.

2.3.4. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

- Mục đích: tìm ra MT dịch thể lên men chìm tốt nhất và biến chủng có khả

năng tổng hợp KS cao nhất trong MT dịch thể.

- Tiến hành

+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 52.13 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa

100ml MT1dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28°C ±

0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.

+ Lên men chọn MT:

Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên nhiều MTdt khác nhau để chọn

MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vơ trùng sang bình nón 500ml chứa

100ml dung dịch các MT dinh dưỡng (mỗi MT làm 2 bình để so sánh) với tỷ lệ

Vgiống:Vmơi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ

quay 140 vòng/phút. Sau 120h lên men lấy các bình ra, lọc loại bỏ sinh khối. Thử

HTKS của dịch lọc, chọn MT có khả năng lên men tốt nhất.

+ Lên men chọn chủng

Các biến chủng tốt nhất được giữ lại sau các lần cải tạo giống đem đi tạo

giống cấp 1. Các giống cấp 1 này được cấy vơ trùng sang các bình nón chứa MTdt



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

25



tốt nhất đã được chọn ra ở trên. Sau khi lên men 120h lấy dịch lọc đi thử HTKS

nhằm chọn ra biến chủng có khả năng lên men tốt nhất.

2.3.5. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung mơi hữu cơ

- Mục đích: Chuyển KS từ dịch lọc sang dịch chiết dung môi hữu cơ. Xác

định dung môi và pH chiết tối ưu.

- Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần.

+ Dịch lọc chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng NaOH 1M và HCl 1M.

+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi khác nhau: Dịch lọc và

dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung mơi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 12 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.

+ Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung mơi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng

sinh theo phương pháp khoanh giấy lọc.

2.3.6. Sơ bộ xác định thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng

- Mục đích: Sơ bộ xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc, làm

cơ sở chọn hệ dung môi thích hợp cho chạy sắc kí cột, xác định thành phần KS

trong các phân đoạn thu được sau chạy cột.

- Tiến hành:

+ Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút. Dùng

bút chì kẻ vạch đánh dấu điểm chấm.

+ Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung mơi

khơng q 1cm), lót giấy lọc xung quanh thành bình ,để n bình khoảng 1h để

bão hòa dung mơi.

+ Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên

bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.

+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Chú ý không để bản mỏng bị lệch và mức

dung môi không được ngập vết chấm.



26



+ Xác định vết theo các phương pháp sau:

• Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt

trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản

mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C. Sau 18-24h lấy ra quan sát. Vòng vơ

khuẩn sẽ xuất hiện nếu có kháng sinh.

• Soi đèn tử ngoại:vết chất thử sẽ hiện màu dưới đèn tử ngoại.

• Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện

màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết.

+ Đo và tính hệ số Rf (Retardation factor).Cơng thức:

Rf = Dv / Ddm

Trong đó:



Dv: Khoảng cách từ điểm chấm tới tâm của vòng vơ khuẩn



hoặc vết hiện hình dưới đèn tử ngoại hay hiện màu bằng thuốc thử hóa học.

Ddm: Chiều dài quãng đường dung môi.

2.3.7. Thu kháng sinh thơ bằng phương pháp cất quay

- Mục đích: thu bột kháng sinh thô tạo điều kiện thuận lợi cho bảo quản và

chuẩn bị cho tinh chế kháng sinh.

Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất

chân không đến cắn. Đổ 1 lượng nhỏ methanol vào bình nhằm hòa tan cắn rồi cho

ra đĩa petri. Sấy trong tủ sấy ở 50°C đến khô. Cạo, thu bột kháng sinh thơ vào ống

sạch, nắp kín, bảo quản trong tủ lạnh.

2.3.8. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột

- Mục đích: loại bỏ các tạp chất, chất phụ nhằm thu được KS tinh khiết.

-Tiến hành

- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ.

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch,

tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

27



30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột, ổn định cột

trong 30 phút.

- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thơ hòa tan trong một lượng tối thiểu

methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết

methanol rồi cho lên cột, để 30 phút cho bão hòa.

- Cho dung mơi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào

ống nghiệm sạch, mỗi phân đoạn 5ml.

- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS

của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS

được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi tách tốt nhất. Các phân đoạn

chính là các phân đoạn có Rf tương đương và có HTKS mạnh.

- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào đĩa Petri sạch, sấy ở

50°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể KS vào ống nghiệm sạch.

2.3.9.Kết tinh lại KS

- Mục đích: Kết tinh lại KS nhằm thu được KS có độ tinh khiết cao hơn

- Tiến hành:

Bột KS thu được sau chạy sắc ký cột ở trên được hòa tan trong khoảng 1ml

ethylacetat vào ống nghiệm. Thêm vào ống nghiệm đó một lượng n- hexan với tỉ lệ

(Vethylacetat :Vn-hexan = 1: 5). Lắc đều. Các tinh thể KS sẽ được kết tinh lại dưới đáy

và trên thành ống nghiệm. Cất trong tủ lạnh và dung đũa thủy tinh cạo trên thành

ống để tăng khả năng kết tinh. Sau đó lọc loại bỏ nước cái nhờ phễu lọc Buchner

thu tinh thể KS tinh khiết. Sấy khô ở 50ºC. Cân ,tính hiệu suất q trình tinh chế.

2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được

Kháng sinh tinh khiết được đo các thơng số: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV,

IR, MS.Các thông số này sẽ bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự

đốn nhóm cấu trúc kháng sinh thu được



28



Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.Nâng cao khả năng sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces

52.13.

3.1.1.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 52.13 trên MT1, thu

được 32 dạng chủng. Đem thử HTKS của các dạng chủng này bằng phương pháp

khối thạch. Kết quả thử HTKS của 12 dạng chủng tốt nhất được trình bày ở bảng

dưới:

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Dạng chủng



Hoạt tính kháng sinh

B.subtilis



P.mirabilis



D (mm)



s (mm)



D (mm)



s (mm)



02



18,38



1,31



18,45



0,19



03



18,79



0,59



18,88



0,83



04



20,42



1,37



19,03



0,35



05



19,1



1,15



18,4



0,53



06



19,64



0,36



19,82



0,85



07



18,69



0,94



18,27



1,31



08



18,73



0,62



18,23



1,51



09



18,23



0,55



19,28



0,47



10



18,54



0,75



18,87



1,57



11



18,99



0,65



19,04



1,09



12



19,17



1,58



18,79



0,34



13



18,93



1,21



18,49



0,64



Nhận xét: Dựa vào bảng ta thấy 3 dạng chủng có hoạt tính tốt nhất là 52.13.4;

52.13.6; 52.13.11. Do đó chúng được giữ lại phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Mục đích: sử dụng kết hợp các phương pháp cải tạo giống thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces 52.13 và tạo ra các biến chủng có HTKS mạnh.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×