Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
1 Nguyên vật liệu và thiết bị

1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Tải bản đầy đủ - 0trang

18



NaNO3



g



0,2



CaCO3



g



K2HPO4



g



0,05



0,1



MgSO4.7H2O



g



0,05



0,05



NaCl



g



0,05



Thạch



g



1,8



2



2



Nước



ml



100



100



100



0,4



pH



6,8 – 7,2



Thành phần



Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

%



%



%



%



MT canh thang



0,5



0,3



0,5



0



MT thạch thường



0,5



0,3



0,5



1,8



pH



7,0-7,4



 Dung môi

Bảng 4 giới thiệu các dung môi sử dụng trong các nghiên cứu cùng các đặc

trưng cơ bản của chúng.

Dung môi

Aceton



Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng

Khối lượng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (°C)

0,79



56



Acetonitril



0,782-0,783



80-82



n-Butanol



0,81



116-118



Butylacetat



0,880-0,885



117-118



Cloroform



1,470-1,480



60-62



Diclorometan



1,32



40



Dimethylformamid



0,95



153



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

19



Ethanol



0,789-0,791



78,3



Ethylacetat



0,889-0,901



70,4



NH4OH 25%



0,880



Methanol



0,791-0,793



64,5



Triethylamin



0,726-0,728



90



1,26



69



n- hexan

 Vật liệu chạy sắc ký



- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1 mm

2.1.2Máy móc thiết bị

- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba

60W, điện thế 220V.

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ lạnh, tủ ấm Memmert, Binder, tủ sấy SL shellab

- Tủ cấy vô trùng Aura VF48, nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong,

cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bơng gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn

cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…



20



2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội

dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1. Sàng lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.

- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần và kết hợp với đột biến hóa học

để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn.

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh

2.2.2.1.Lên men

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.

- Thực hiện lên men từ các biến chủng tốt nhất đã được giữ lại sau mỗi lần

chọn lọc cải tạo giống, lựa chọn biến chủng có khả năng lên men tạo kháng sinh

mạnh nhất.

2.2.2.2.Chiết tách kháng sinh :

- Tìm dung mơi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung mơi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh khiết thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ khối xác định khối lượng phân tử của KS tinh khiết

- Đo phổ IR, phổ UV sơ bộ xác định được các nhóm chức và các cấu trúc

đặc trưng trong phân tử kháng sinh.



2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

Chủng giống Streptomyces 52.13 được nuôi cấy và giữ giống như sau:



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

21



- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT1, ủ cho phát

triển ở 28-29°C.Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào

tủ lạnh bảo quản ở 2°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.

2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV

kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển

của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.

- Tiến hành:

+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (với VK) để tạo thành hỗn dịch VSV có

nồng độ 106-108 tế bào/ml.

+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội

đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào đĩa Petri 20ml/đĩa.

+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

• Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được

tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50C,

sau đó đặt lên bề mặt mơi trường đã cấy VSV kiểm định.

• Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV

sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.

• Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT

đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.

+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với

vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.

+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vơ khuẩn bằng thước kẹp Palmer

có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vơ

khuẩn xử lý theo cơng thức:



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×