Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
b.Các phương pháp lên men

b.Các phương pháp lên men

Tải bản đầy đủ - 0trang

12



+ Ưu điểm:

Hiệu suất sử dụng không gian cao, lượng hoạt chất tổng hợp trong 1 thể tích

mơi trường cao, hiệu suất lên men cao.

Môi trường nuôi cấy là 1 thể thống nhất, vì vậy có thể kiểm sốt quy trình

lên men 1 cách dễ dàng. Thiết bị tự động hóa tiết kiệm được mặt bằng và nhân lực.

+ Nhược điểm

Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn

Cần thiết bị chịu áp lực.

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được ni cố định trong bình lên

men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm.

Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình ni cấy có bổ sung thêm mơi trường

dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả

sử dụng bình lên men.

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát

triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng

thời bổ sung đồng lượng MT mới vào bình.

+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT

dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau

những khoảng thời gian nhất định.[11], [13]



1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Giai đoạn này có vai trò rất quan trọng bởi sản phẩm thu được sau khi lên

men thường không bền vững, hàm lượng KS trong dịch lên men thường thấp. Do

đó, cần tách riêng KS khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt các tiêu



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

13



chuẩn cần thiết. Cơng đoạn tinh chế góp phần quyết định giá thành của sản

phẩm.[12]

1.5.2.Các phương pháp chiết tách

a.Chiết xuất

Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác ( thường

dùng DMHC hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp cần

nghiên cứu.[3]

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha khơng hòa lẫn vào

nhau.

b.Tách và tinh chế sản phẩm

Tách sản phẩm là sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa học, vật lí, hóa lý

nhằm đi từ 1 hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp giản đơn và từ hỗn hợp giản

đơn tách riêng từng chất. Tinh chế là quá trình tạo sản phẩm tinh khiết dùng cho

nghiên cứu tiếp theo. [19]

Phương pháp thường được sử dụng hiện nay để tách và tinh chế sản phẩm là

sắc ký.

Các phương pháp sắc ký hay dùng:[1], [9]

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên

khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn

(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá

đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.

+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự

phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo

thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ

hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.

Ngồi ra để tinh chế còn hay dùng phương pháp kết tinh: phương pháp này

dựa trên sự hòa tan có giới hạn của một chất trong dung dịch [10]. Từ đó có thể áp



14



dụng hòa tan chất (chất này có thể chưa tinh khiết) vào 1 DM sau đó thêm 1 dung

mơi thứ 2 vào. Do độ tan trong dung môi thứ 2 khác nên các tinh thể của chất sẽ

kết tinh và ta có thể tách chúng ra 1 cách dễ dàng. Độ tinh khiết của chất đó đã

tăng.



1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến

Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi

mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích.

Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có

mối quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đơi thì sự

hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân

tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ

năng lượng ánh sáng UV-VIS. [2] , [9]

1.6.2.Phổ hồng ngoại

Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái

năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử.

Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước

sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[1], [9]

1.6.3.Khối phổ

Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích

của ion (m/z) tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng

chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) bắn phân phá phân tử hữu cơ

ở chân khơng cao (10-6mmHg). Trong q trình đó các chất hữu cơ bị ion hóa và bị

phá vỡ thành các mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện

bằng một số vạch pic có cường độ khác nhau tập hợp thành khối phổ đồ.[1], [20]



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

15



1.7. Một số kết quả nghiên cứu về KS

1.7.1.Ảnh hưởng của Panamycin - 607 lên các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp

sản xuất bởi Streptomyces spp.

Sự ảnh hưởng của Panamycin – 607 lên sự phát triển của khuẩn ty khí sinh

và các chất kháng sinh được sản xuất bởi Streptomyces đã được chứng minh. Tiếp

xúc với 6,6 µg Panamycin – 607 kích thích làm tăng 2,7 lần puromycin được sản

xuất bởi Streptomyces alboniger NBRC 1278, trong đó trước tiên là nó làm tăng

khuẩn ty khí sinh. Panamycin – 607 cũng kích thích làm tăng sản xuất sản phẩm

tương ứng streptomycin của S.griseus NRBC 12875 và cirenubin A và B của

S.tauricus JCM 4837 lần lượt là 1,5; 1,7 và 1,9 lần. Kháng sinh được sản xuất bởi

Streptomyces sp. 91-a được xác định là virginiamycin M1, và khả năng tổng hợp

của nó đã tăng lên 2,6 lần bởi panamycin -607. Kết quả này đã chứng minh rằng

không chỉ khơi phục hay kích thích sự phát triển của khuẩn ty khí sinh mà còn làm

tăng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp.[21]

1.7.2. Các polyene macrolid mới họ hàng với nystatin có vùng polyol cải biến

thơng qua cơng nghệ sinh tổng hợp S. noursei

Nystatin là một kháng sinh nhóm polyene macrolid có phổ kháng nấm rộng,

hiệu quả cao và ít có xu hướng kháng thuốc. Tuy nhiên, KS này có độc tính tương

đối cao, đặc biệt là đối với các tế bào thận. Nystatin được sản xuất bởi S.noursei.

Cấu trúc của nystatin tương tự amphotericin B. Amphotericin B có 7 liên kết đơi

trong phần polymer trong khi nystatin có 4 liên kết đôi. Sự khác biệt này dẫn đến

khả năng kháng nấm của nystatin cao hơn amphotericin do sự tương tác kị nước

với màng sterol hiệu quả hơn. Tiến hành đột biến gen GG5073SP của S. noursei,

sản xuất heptaneic nystatin đồng đẳng S44HP đã cải thiện đáng kể khả năng kháng

nấm nhưng lại tăng độc tính so với nystatin. Bất hoạt gen nysN P450

monooxygenase của biến chủng GG5073SP mang lại biến chủng S.noursei đột

biến có khả năng sản xuất nystatin đồng đẳng BSG005 (16 decarboxy – 16 –



16



methyl – 28, 29 – didehydronystatin).Hoạt chất này có khả năng kháng nấm cao

hơn của S44HP và giảm độc tính hơn.[23]

1.7.3.Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh

ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces

Một con đường sinh tổng hợp sử dụng acid pivalic như là đơn vị khởi đầu

đã được phát hiện ở ba loài vi khuẩn Alicyclobacillus acidoterrestris, Rhodococcus

erythropolis và Streptomyces avermitilis. Khi thêm acid pivalic được đánh dấu

bằng đồng vị Deuteri vào môi trường dinh dưỡng của A. acidoterrestris và R.

erythropolis, nó sẽ kết hợp với các acid béo để tạo thành acid béo có thêm nhánh

tert- butyl (t- FAs). Thêm vào đó, trong R. erythropolis, acid pivalic chuyển hóa

thành hai đơn vị khởi đầu là acid isobutyric và acid 2- methylbutyric, tương ứng là

tiền chất của iso-FAs và anteiso- FAs. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở lồi S.

avermitilis khi có thêm acid pivalic mang lại ba nhánh FAs. Ngoài con đường này,

cả acid pivalic và acid 2- methylbutyric cũng được kết hợp trong sinh tổng hợp

kháng sinh avermectin. [22]



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

17



CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu



Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 52.13 do Bộ môn Vi sinh – Sinh

học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được phân lập từ mẫu đất Hà Nội.

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ mơn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được

trình bày ở bảng 1.

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định

Vi khuẩn Gram(+)

Vi khuẩn Gram(-)

Bacillus subtilis ATCC 6633



Proteus mirabilis BV 108



 Mơi trường

• Các mơi trường ni cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở

bảng 2.

• Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT ni cấy xạ khuẩn

nhưng loại bỏ thạch.

• Các MT ni cấy VSV kiểm định: thành phần được trình bày ở bảng 3.

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút

Thành phần



Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Đơn vị

MT1

MT2



MT5



Tinh bột



g



Glucose



g



1



Cao thịt



g



0,3



Pepton



g



0,3



KNO3



g



KCl



g



2



2



0,1

0,05



2,4



18



NaNO3



g



0,2



CaCO3



g



K2HPO4



g



0,05



0,1



MgSO4.7H2O



g



0,05



0,05



NaCl



g



0,05



Thạch



g



1,8



2



2



Nước



ml



100



100



100



0,4



pH



6,8 – 7,2



Thành phần



Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

NaCl

Cao thịt

Pepton

Thạch

%



%



%



%



MT canh thang



0,5



0,3



0,5



0



MT thạch thường



0,5



0,3



0,5



1,8



pH



7,0-7,4



 Dung môi

Bảng 4 giới thiệu các dung môi sử dụng trong các nghiên cứu cùng các đặc

trưng cơ bản của chúng.

Dung môi

Aceton



Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng

Khối lượng riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (°C)

0,79



56



Acetonitril



0,782-0,783



80-82



n-Butanol



0,81



116-118



Butylacetat



0,880-0,885



117-118



Cloroform



1,470-1,480



60-62



Diclorometan



1,32



40



Dimethylformamid



0,95



153



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

b.Các phương pháp lên men

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×