Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Hiện nay, giới khoa học quan niệm rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi ...

Hiện nay, giới khoa học quan niệm rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi ...

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

3



Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây



bệnh.

-



Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài.



-



Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ

thể. [11]



1.1.3.Đánh giá tác dụng:

Theo đơn vị tác dụng (IU) :thường dùng cho cá sản phẩm thiên

nhiên và không tinh khiết.

-



Theo khối lượng chất chuẩn (g,mg..): thường dùng cho các chế

phẩm bán tổng hợp và tinh khiết. [8]



1.1.4 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm

của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân

loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên

cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện

khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về

các đặc điểm khác.[8]

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất

sau đây:

- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactamase

+ Penicillin: oxacillin, ampicillin..

+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim…

+ Các β-lactamase khác: carbapenem, chất ức chế β-lactamase

- Các kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol..)

- Các kháng sinh có cấu trúc aminosid (streptomycin, gentamicin…)

- Các KS nhóm lincosamid (lincomycin, clindamycin…)



4



- Các KS nhóm quinolon (acid nalidixic…)

- Các KS nhóm Co – trimoxazol (co-trimoxazol..)

- Các kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline…)

- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…)

- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…)

- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)

- Các kháng sinh khác (rifapicin…) [8], [18]

1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp

khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác

hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi

nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Các kiểu chủ yếu:

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào : ức chế tổng hợp vách tế bào vi

khuẩn làm VK bị tiêu diệt. Một số KS như vancomcin, β- lactamase… tác

dụng theo cơ chế này.

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất: KS làm thay đổi tính thấm của màng

dẫn đến làm rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào VK với môi trường

làm VK bị tiêu diệt.

- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN: ức chế sự tổng hợp ADN từ quá trình sao

chép và phiên mã. VD: actinomycin, rifampicin..

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein:

+ Gắn vào tiểu đơn vị 30S hoặc 50S, làm gián đoạn quá trình tổng

hợp protein có khả năng kìm hãm vi khuẩn. VD: Cloramphenicol,

tetracycline macrolid và lincosamid…

+ Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm sai lệch q trình tổng

hợp protein có khả năng tiêu diệt VK. VD: các aminosid, spectinomycin…



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

5



- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian: ức chế tổng hợp acid folic. VD:

Co-trimoxazol.

- Tác dụng lên hệ hơ hấp [18]

Hình sau đây giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh

chính.[18]



Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính

1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh

- Trong y học: Kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn,

nhiễm nấm và một số bệnh ung thư.

- Trong chăn nuôi: Điều trị các bệnh nhiễm trùng ở động vật như dùng

griseofulvin để điều trị viêm phổi cấp, viêm vú của trâu bò ; dùng cloramphenicol

để điều trị các bệnh do Brucella gây ra.



6



- Trong nông nghiệp: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus

gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây

bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả.

- Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực

phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do

Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).[4], [7]



1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

1.2.1.Đặc điểm hình thái:

Streptmyces là 1 chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi trong

tự nhiên. Nơi sống của các loài thuộc chi Streptomyces rất đa dạng (đất, thủy

vực…). Chúng thuộc VK thật phát triển dạng sợi phân nhánh là các VK Gr(+), có

tỉ lệ G+C>55% .[17]

Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khí sinh.

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong

suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra mơi trường một số

loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung mơi hữu cơ.

+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong khơng khí.

Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử.

+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng,

móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh

sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da

cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vơ

tính.[7], [17]

Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. [17]



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

7



`Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

1.2.2.Đặc điểm sinh lý:

Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng

phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời

thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 2530°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. [4], [7]

1.2.3.Đặc điểm cấu tạo:

Cấu tạo của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất,

tế bào chất.

- Thành tế bào: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20nm. Thành tế bào

thuộc nhóm CW I, có chứa L – DAP và glycin.

- Màng tế bào chất: dày 7,5 – 10 nm, khơng chứa cellulose và kitin.

- Meosome: nằm phía trong tế bào chất hình phiến,bọng hay hình ống.[16]

1.2.4.Khả năng tạo sắc tố:

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố

của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7]



8



1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên

VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần

khiết, có cá thể có hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải

chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11]

Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên

cứu ban đầu, nó khơng có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng

có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến

nhân tạo.

1.3.2.Đột biến cải tạo giống

Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: hóa học

(ethylamine, acid nitrơ…), vật lí (UV, tia X…) và sinh học. Trong đó, các tác nhân

vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các

VSV. Những cá thể còn sống sót sẽ có sự ĐB gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn

đến hoặc làm mất khả năng tạo KS (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng

hợp kháng sinh lên mạnh (ĐB dương). [4]

- Đột biến bằng UV:

Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với các tế bào VSV có

kích thước nhỏ thì tia UV có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Tia UV có thể làm cho

các base pyrimidin trên cùng 1 mạch của ADN hình thành các cấu trúc dimer T-T,

C-C, T-C. Các dimer ảnh hưởng tới sự ghép đôi bổ sung trong sao chép để lại 1 vết

khuyết trên mạch bổ sung gây ra ĐB gen.[14]

- Đột biến bằng HNO2:

Axit nitrơ là chất gây ĐB mạnh. Nó có tính oxy hóa mạnh làm loại nhóm

amin (NH2) ra khỏi A, G và C. Phản ứng này làm thay đổi amino thành keto và

làm thay đổi liên kết hydro của các base này. A sau loại amin có xu hướng liên kết



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

9



với C; C sau khi chuyển thành U có xu hướng liên kết với A; G chuyển thành

xanthin nhưng xanthin vẫn liên kết với C nên trường hợp này không gây ĐB.[16]

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến

hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử.

1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn

Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền

khơng bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.

Thơng thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng

VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền

sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khơ ở nhiệt

độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh,

làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được

đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng

thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng

thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[13]



1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn

1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn

Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh

tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh

tranh trong môi trường dinh dưỡng. Một số khác lại cho rằng việc hình thành KS

giúp cho sự tồn tại của VK trong điều kiện sống khắc nghiệt. Tuy nhiên hầu hết

đều đồng ý công nhận KS là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, được hình thành vào

cuối pha sinh trưởng đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.

Mặc dù KS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng

nhưng quá trình tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định:



10



- KS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thơng qua một chuỗi

phản ứng enzyme.

- KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa khác nhau.

- KS được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển hóa sơ

cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

Hình dưới giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải

qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy

tàn.[11].



Hình 1.3: Đường cong biểu diễn sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn

Một số chủng xạ khuẩn có thể tổng hợp được nhiều loại kháng sinh có cấu

trúc và tác dụng tương tự nhau. Việc tổng hợp này do các cơ chế điều khiển đa

gen, ngoài gen và các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme,

cofactor qui định.[13], [15]

1.4.2.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp KS

a) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và chủng giống sử dụng[11], [24]

- Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp KS là 22 – 28ºC

- pH mơi trường: thường pH thích hợp nhất là pH trung tính.

- Độ thơng khí: xạ khuẩn là lồi hiếu khí, cần đảm bảo thong khí tốt đặc biệt là ở

giai đoạn nhân giống tức 6 – 12 giờ đầu của q trình ni cấy. Nồng độ O2 thích

hợp cho sinh tổng hợp KS là 2 – 8 ml O2 / 100ml.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

11



- Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh tổng

hợp cao nhất là 36 – 72 giờ tuổi. Lượng giống 2 – 10 %

b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men:[11] , [24]

- Nguồn Carbon: có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành KS. Nguồn

carbon thường được sử dụng nhất là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau

mà sử dụng các loại khác nhau. Có thể là: glucose, fructose…hoặc 1 số các loại

acid hữu cơ hay chất béo khác.

- Nguồn nitơ: gồm nitơ hữu cơ và vơ cơ. Nguồn nitơ hữu cơ có thể là các hợp chất

từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Nguồn vô cơ thường là muối amoni.

- Nguồn phosphate vô cơ : đóng vai trò là tác nhân điều hòa sự tổng hợp KS. Nồng

độ thích hợp: 10mg/ml.

- Các yếu tố vi lượng: Nếu mơi trường lên men có nguồn gốc dinh dưỡng tự nhiên

thì hầu hết các yếu tố vi lượng đều đã có sẵn khơng cần bổ sung thêm. Việc bổ

sung thêm các hợp chất giàu yếu tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng

kể khả năng sinh tổng hợp của KS của nhiều loại xạ khuẩn.

1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces

a.Định nghĩa: Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt

động sống của VSV nhờ xúc tác của enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và

các hợp chất trung gian cần cho chúng.[5] , [12]

b.Các phương pháp lên men

- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn

hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi khơng

khí để hơ hấp trên bề mặt MT.

+ Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.

+ Nhược điểm: diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất,

hiệu suất sử dụng thấp.

- Phương pháp lên men chìm: VSV nuôi trong MT lỏng, phát triển 3 chiều.



12



+ Ưu điểm:

Hiệu suất sử dụng không gian cao, lượng hoạt chất tổng hợp trong 1 thể tích

mơi trường cao, hiệu suất lên men cao.

Môi trường nuôi cấy là 1 thể thống nhất, vì vậy có thể kiểm sốt quy trình

lên men 1 cách dễ dàng. Thiết bị tự động hóa tiết kiệm được mặt bằng và nhân lực.

+ Nhược điểm

Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn

Cần thiết bị chịu áp lực.

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được ni cố định trong bình lên

men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm.

Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.

+ Lên men có bổ sung: trong q trình ni cấy có bổ sung thêm mơi trường

dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả

sử dụng bình lên men.

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát

triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng

thời bổ sung đồng lượng MT mới vào bình.

+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT

dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau

những khoảng thời gian nhất định.[11], [13]



1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Giai đoạn này có vai trò rất quan trọng bởi sản phẩm thu được sau khi lên

men thường không bền vững, hàm lượng KS trong dịch lên men thường thấp. Do

đó, cần tách riêng KS khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt các tiêu



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

13



chuẩn cần thiết. Cơng đoạn tinh chế góp phần quyết định giá thành của sản

phẩm.[12]

1.5.2.Các phương pháp chiết tách

a.Chiết xuất

Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác ( thường

dùng DMHC hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp cần

nghiên cứu.[3]

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha khơng hòa lẫn vào

nhau.

b.Tách và tinh chế sản phẩm

Tách sản phẩm là sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa học, vật lí, hóa lý

nhằm đi từ 1 hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp giản đơn và từ hỗn hợp giản

đơn tách riêng từng chất. Tinh chế là quá trình tạo sản phẩm tinh khiết dùng cho

nghiên cứu tiếp theo. [19]

Phương pháp thường được sử dụng hiện nay để tách và tinh chế sản phẩm là

sắc ký.

Các phương pháp sắc ký hay dùng:[1], [9]

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên

khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn

(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá

đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.

+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự

phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo

thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ

hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.

Ngồi ra để tinh chế còn hay dùng phương pháp kết tinh: phương pháp này

dựa trên sự hòa tan có giới hạn của một chất trong dung dịch [10]. Từ đó có thể áp



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Hiện nay, giới khoa học quan niệm rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi ...

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×