Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin

Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

7



 Tác giả Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Điệp, Nguyễn

Thanh Hải cũng đã nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin

bằng phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất. Kết quả cho thấy đây là phương

pháp đơn giản, có độ chính xác đạt yêu cầu, tiến hành nhanh và tiết kiệm thời gian

có thể sử dụng định lượng nhanh hàm lượng PES và LOR trong các chế phẩm bào

chế kết hợp bằng các máy đo quang thông dụng [9].

 Các nghiên cứu nước ngoài

 Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong dịch sinh học:

 Nghiên cứu “xác định đồng thời Loratadin và Pseudoephedrine sulfat trong

huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ - kỹ thuật phun điện tử”

do các nhà hoa học thuộc đại học dược Trung Quốc tiến hành đánh giá sinh khả

dụng của Loratadin và Pseudoephedrin từ viên giải phóng có kiểm sốt.

Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lượng gồm :

- Chiết hoạt chất từ huyết tương người bằng ethyl ether

- Cột sắc ký : ODS Shimazu (5µm ; 2,1 x 150mm)

- Pha động : Acetnitril- nước (80:20) chứa 0,1% acid acetic băng

- Tốc độ dòng : 0,2mL/phút

- Thể tích bơm mẫu : 5µL

- Chuẩn nội : diazepam cho LOR và phenylpropanolamin cho PES

- Kiểu khối phổ : MS/MS, nguồn ion hóa HESI(+)

- Kết quả : Khoảng nồng độ tuyến tính : 5 - 1000 ng/mL với PES và 0,05 – 10

ng/mL với LOR. Giới hạn định lượng : 10 pg/mL với LOR và 50 pg/mL với

PES [16].

 Các nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc:

 Một nghiên cứu taị đại học Dược hoàng gia Malaysia đã định lượng đồng

thời Loratadin và Pseudoephedrine hydrochlorid trong chế phẩm viên nén bằng

phương pháp HPLC detector UV- VIS

Các điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký : Luna (5µm; 4,6 x 150mm)



8



- Pha động : Dung dịch amonium dihydro orthophosphat 30mM : acetonitrile

(4:6, tt/tt)

- Tốc độ dòng: 1mL/phút.Thể tích tiêmm mẫu: 20 µL. Bước sóng phát hiện:

265nm.

- Kết quả: Khoảng nồng độ tuyến tính: 5 - 200 µg/mL với PES và 0,25 – 10

µg/mL với LOR) [14].

 Tại Ấn Độ, các nhà khoa học đã đồng thời tiến hành nhiều phương pháp

khác nhau để định lượng đồng thời LOR và PES trong chế phẩm thuốc.

- Thứ nhất là phương pháp đo quang ở nhiều bước sóng, với 2 bước sóng cực

đại là 257 và 283nm.

- Thứ hai là phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất, đo độ hấp thụ tại hai

bước sóng là 308,6 và 263 nm

- Thứ ba là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng :

+Cột sắc ký : ODS (5µm; 4,6 x 150mm).

+ Pha động : dd amoni acetat (3,85g/l): Methanol (20:80) pH 7,5

+ Chuẩn nội : nimesulid

Kết quả: Phương pháp thứ nhất cho kết quả khá nhanh, ở phương pháp thứ hai

đã loại bỏ hoàn toàn được ảnh hưởng của các thành phân tá dược và tạp khác,

phương pháp thứ ba khá nhanh (thời gian phân tích một mẫu khoảng 15 phút), cho

kết quả chính xác [15].



1.2. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ.

Khối phổ ( masspectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và

điện tích của ion (m/z).

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, sau đó được gia tốc và tách riêng

nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Quá trình này diễn ra trong thiết

bị chân không với áp suất của hệ dao động trong khoảng 10-8 – 10-6 Pa. Tín hiệu



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

9



tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác

nhau tập hợp lại thành khối phổ.

1.2.2. Các bộ phận của máy phân tích khối phổ.[8], [11]



Hình 2.1.Các bộ phận của máy phân tích khối phổ.

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu (Inlet)

Có vai trò nạp mẫu vào máy, ở đây mẫu được nạp gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu

ra của bộ phận sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ.

1.2.2.2. Bộ nguồn ion ( Ion source)

Vai trò là ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi.

Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau, hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa

bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI).

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI :

Các phân tử chất phân tích cùng dòng pha động sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được

đưa vào một ống mao quản cao thế 2-5 KV và phun vào nguồn ion hóa dưới dạng

sương mù. Do tác động của điện thế cao mà bề mặt các hạt sương mù được tạo

thành bị nhiễm điện, đồng thời dưới tác động của luồng khí nitơ nóng, xảy ra hiện

tượng bay hơi dung môi làm cho các hạt sương mù bé dần cho đến khi bị phân tách



10



và giải phóng các ion mang điện. Phần lớn các tiểu phân dung môi, tiểu phân không

mang điện hoặc mang điện trái dấu với ion chất phân tích sẽ bị bơm hút ra ngồi.

Ion chất phân tích và một phần các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ đi vào bộ phận

vận chuyển ion nhờ chênh lệch áp suất.

1.2.2.3. Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube)

Bộ phận vận chuyển ion có cấu tạo như một ống thép chịu nhiệt, tại đây các ion

dung mơi còn sót lại sẽ tiếp tục bị bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao.

1.2.2.4. Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense)

Cấu tạo gồm hai thanh kim loại ghép với nhau thành một cặp điện cực. Khi áp

điện thế vào, các ion phân tích và các tiểu phân mang điện cùng dấu sẽ được tập

trung lại thành dòng ion di chuyển với tốc độ cao vào trong bộ phận phân tích khối.

1.2.2.5.Bộ phận phân tích khối (mass analyze)

Có nhiệm vụ tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ

tác dụng của điện từ trường để đi tới detector.

Trong đề tài này chúng tơi sử dụng bộ phân tích tứ cực chập ba

(Triplequadrupoles analyser).

Bộ phân tích khối gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau, các tứ cực được cấu tạo bởi

bốn thanh kim loại ghép với nhau tạo thành hai cặp điện cực, trong đó Q1, Q3 làm

nhiệm vụ phân tích.

- Tại Q1: Tách các ion, lựa chọn ion chất phân tích ( ion mẹ - parent ion) để đi

vào Q2

- Tại Q2: Với áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với các phân tử khí

trơ có mặt như nitơ, heli, argon đã được cung cấp động năng. Nhờ va chạm này,

năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng của chúng, phân mảnh tạo

ra các ion con. Các mảnh ion con được tạo thành có số khối khác nhau sẽ tiếp tục đi

vào Q3.

- Tại Q3: Hệ thống điều chỉnh để ưu tiên cho loại ion con đặc trưng của chất

phân tích đi qua và di chuyển đến detector



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

11



Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần – MS/MS

(nhận diện chất phân tích thơng qua số khối của ion mẹ và mảnh ion con).

1.2.2.6. Bộ phận phát hiện (detector).

Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến từ bộ phận phân tích khối thành tín hiệu

điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

1.2.2.7. Hệ thống bơm chân không (high vacuum system).

Hệ thống bơm chân không hoạt động nhằm duy trì mơi trường chân khơng ở

nguồn ion hóa và tồn bộ hệ thống phân tích khối. Áp suất bên trong hệ thống duy

trì trong khoảng 10-8 – 10-6 Pa.

1.2.3. Ưu nhược điểm của hệ thống

 Ưu điểm

Kỹ thuật LC- MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao, có thể dùng để phân

tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp. Do đó kỹ thuật này ngày

càng được ứng dụng nhiều trong phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch

sinh học cho các nghiên cứu dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học.

 Nhược điểm

Đòi hỏi hóa chất có độ tinh khiết cao, dụng cụ đảm bảo sạch. Thiết bị có cấu tạo

phức tạp, giá thành cao. Người sử dụng máy có trình độ chuyên môn cao.

1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) [17], [22], [23].

UPLC là phương pháp được phát triển từ HPLC, nguyên tắc hoạt động và các

thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký của UPLC hồn tồn tương tự với HPLC,

tuy nhiên UPLC có cải tiến về phần cứng cũng như về phần hóa học để tăng về hiệu

năng thiết bị. Máy UPLC thực chất là một máy sắc ký lỏng chạy tại áp suất siêu

cao (từ 9000 psi đến 15000 psi), sử dụng cột sắc ký đường kính nhỏ (thơng thường

< 2,1 mm); kích thước tiểu phân pha tĩnh nhỏ (<2,2 µm), số đĩa lý thuyết lớn, chiều

cao đĩa lý thuyết nhỏ. Ngoài ra phần cứng liên quan như phần bơm mẫu, phần thu

nhận dữ liệu (detetor) và xử lý số liệu cũng được cải tiến để đồng bộ trong tồn hệ

thống. UPLC có khả năng đồng thời tăng tốc độ phân tích (lên khoảng 9 lần), tăng

độ nhạy (lên khoảng 2 lần) và độ phân giải (lên khoảng 3 lần) so với khi phân tích



12



trên HPLC. Hiện nay trên thế giới đang coi UPLC là đỉnh cao của thiết bị LC và là

đầu vào tiêu chuẩn của hệ thống khối phổ.

So với HPLC, UPLC có một số ưu điểm sau:

- Tốc độ phân tích nhanh;

- Kết quả phân tích đáng tin cậy hơn do độ nhạy và độ phân giải tốt hơn;

- Tiêu tốn ít dung mơi hơn;

- Chi phí nhân cơng ít hơn;

- Diện tích phòng thí nghiệm cũng cần ít hơn.



1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH

SINH HỌC

Thẩm định một phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là q trình

xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của

phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích

thực tế.

Có khá nhiều hướng dẫn như của FDA – Mỹ (2001), EMEA (2011), ASEAN

(2003) [8], [13], [19], [20], nhưng nhìn chung người ta thường tiến hành thẩm định

với các chỉ tiêu sau :

1.3.1. Độ chọn lọc – độ đặc hiệu .

Độ chọn lọc- đặc hiệu là khả năng phân biệt các chất có trong mẫu thử khi tách

và định lượng hai thành phần trở lên trong một hỗn hợp chất.Theo FDA, phương

pháp phân tích được coi là chọn lọc – đặc hiệu đối với chất phân tích (CP) và chuẩn

nội (IS) khi trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (có nồng độ chất CP tương ứng với nồng

độ thấp nhất của đường chuẩn ), các pic của CP và IS phải được nhận diện rõ ràng

và có hình dạng cân đối .Ngồi ra còn u cầu đáp ứng pic của mẫu trắng so với

mẫu chuẩn tại thời gian lưu của CP không vượt quá 20%, tại thời gian lưu của IS

không vượt quá 5%.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

13



1.3.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ).

Theo quy định của FDA, mẫu chuẩn có nồng độ CP tương ứng với nồng độ thấp

nhất của đường chuẩn được coi là LLOQ khi pic của CP được nhận diện rõ ràng,

hình dạng cân đối và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại thời

gian lưu của CP, độ đúng đạt 80 -120% so với nồng độ thực và độ chính xác có giá

trị RSD ≤ 20%.

1.3.3. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính.

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ CP trong đó có sự tương quan tuyến tính

giữa nồng độ CP và tỷ lệ đáp ứng pic CP/IS

Theo FDA, đường chuẩn phải bao gồm 6 - 8 điểm bao phủ toàn bộ khoảng tuyến

tính, hệ số tương quan lớn hơn 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao

gồm cả điểm có nồng độ thấp nhất và điểm có nồng độ cao nhất phải có độ đúng

nằm trong khoảng từ 85% đến 115% với giá trị RSD ≤ 15%, riêng điểm thấp nhất

của đường chuẩn cho phép có độ đúng nằm trong khoảng từ 80% đến 120% với giá

trị RSD ≤ 20%.

1.3.4. Độ đúng.

Độ đúng là chỉ tiêu phản ánh sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực

hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận

Độ đúng được tính bằng phần trăm giữa giá trị thu được và giá trị thực.Độ đúng

phải đạt từ 85% đến 115%.

1.3.5.Độ chính xác.

Độ chính xác là chỉ tiêu phản ánh mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép

đo từ nhiều lần lấy mẫu phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ

Độ chính xác được thể hiện ở giá trị RSD, yêu cầu RSD phải không lớn hơn

15%.

1.3.6. Hiệu suất chiết.

Hiệu suất chiết là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của CP và IS sau quá trình

chiết tách xử lý mẫu



14



Theo FDA, hiệu suất chiết của CP và IS không được quá cao ( dưới 110%),

không quá thấp (trên 30%) và ổn định (hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ

không được khác nhau quá 15%).

1.3.7. Độ ổn định.

Theo FDA, các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện phân tích nếu giá trị nồng

độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và các giá trị

RSD giữa các lần phân tích khơng q 15%.



CHƯƠNG 2 . ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.1. NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ.

 Chất chuẩn

Loratadin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 99,24%, độ ẩm 0,02%

Pseudoephedrin – chuẩn phòng thí nghiệm, hàm lượng 100%, độ ẩm 0,01%.

 Chất chuẩn nội:

Diazepam – chuẩn phòng thí nghiệm;

Domperidol – chuẩn phòng thí nghiệm.

 Dung mơi, hóa chất:

Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN ) – Merk, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh

khiết dùng cho HPLC và LC/MS.

Các dung mơi hóa chất khác như : Cloroform, Diethylether, Dicloromethan, các

dd: Amoni acetat, Acid acetic, Acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân

tích (p.a)

 Huyết tương trắng : được lấy từ chó khỏe mạnh và chưa dùng thuốc.

 Thiết bị dụng cụ:

Tất cả các thiết bị dụng cụ đều được chuẩn hóa theo quy định ISO/ IEC 17025 2005

-



Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters Xevo TQD – Waters (Mỹ);



-



Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg) – Sartorious (Đức);



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

15



-



Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2- 16K – Sartorious (Đức);



-



Thiết bị bay hơi dung môi Reatic – Thermo III – Thermo scientific (Mỹ);



-



Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP-236 – Velp (Ý);



-



Micropipet Eppendorf loại 10- 100, 100- 1000µL – Eppendorf (Đức);



-



Bình định mức, pipet thủy tinh classA , Prolabo – Pháp.



2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.

 Trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích.

 Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương trắng của chó khơng có LOR và PES.

 Mẫu tự tạo: là các mẫu huyết tương trắng của chó có LOR và PES ở nồng độ

thích hợp.

 Trong ứng dụng định lượng trên mẫu thực:

 Viên Clarinase ® tablet (Shering – Plough Labo N.V);

 Mẫu thử: là các mẫu huyết tương chó sau khi cho uống viên Clarinase

 Súc vật: Chó khỏe mạnh, giống đực, cân nặng 9-10kg, được chăm sóc và lấy

máu tại bộ mơn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội



2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PES bằng kỹ thuật LCMS/MS: Lựa chọn phương pháp chiết tách LOR và PES từ huyết tương chó, lựa

chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội và điều kiện khối phổ.

 Thẩm định phương pháp phân tích : Thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng

– độ chính xác,hiệu suất chiết, độ ổn định.



2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.4.1.Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu

 Chuẩn bị các mẫu chuẩn.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Các nghiên cứu định lượng đồng thời Loratadin và Pseudoephedrin

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×