Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

22



Hình 3.2. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Eclipse XDB

Nhận xét: từ bảng trên nhận thấy cột Eclipse XDB cho thời gian lưu hợp lý,

hệ số đối xứng F nằm trong khoảng cho phép (0,8 ≤ F ≤ 1,5), do vậy chúng

tôi lựa chọn cột Eclipse XDB C18 cho nghiên cứu.

3.1.2. Lựa chọn bước sóng thích hợp

Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện felodipin, chúng tôi tiến hành quét

phổ UV-VIS của pic felodipin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn felodipin nồng

độ 20 µg/ml.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

23



Hình 3.3. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Felodipin chuẩn

Kết quả: ở hình cho thấy felodipin có 3 cực đại hấp phụ ở các bước sóng 197

nm, 238 nm, 362 nm. Để giảm ảnh hưởng của nền mẫu nhưng vẫn đảm bảo

độ nhạy của phương pháp chúng tơi lựa chọn bước sóng đo là 362 nm

3.1.3. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động

• Lựa chọn tốc độ dòng:

Tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký đã chọn với tốc độ dòng thay đổi 0,8

ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút, nhằm chọn tốc độ dòng thích hợp đảm bảo

việc chất phân tách tốt và định lượng felodipin đồng thời rút ngắn thời gian

phân tích, áp suất cột lại khơng q cao.

• Lựa chọn pha động:

Song song với việc lựa chọn tốc độ dòng, tiến hành nghiên cứu thành phần

pha động dựa trên hỗn hợp gồm Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM

pH 3,0: Methanol. Khảo sát pha động với Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4

25 mM pH 3,0: Methanol các tỷ lệ thay đổi là: 40:40:20, 40:30:30, 30:30:40.



24



Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0 được chuẩn bị như sau: Hòa tan 1,7 g

kali dihydrophosphat trong 400 ml nước, điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung

dịch acid phosphoric và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].

Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.4, 3.5, 3.6

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động

STT

1

2

3



Tỷ lệ pha động

ACN: đệm: MetOH

40:40:20

40:30:30

30:30:40



Thời gian

lưu tR(phút)

14,824

9,278

7,269



Hình 3.4. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1



Hình 3.5. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 2



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

25



Hình 3.6. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3

Nhận xét: từ kết quả ở bảng 3.2 thấy hệ dung môi Acetonitril: dung dịch đệm

KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol tỷ lệ: 30:30:40 với tốc độ dòng 1,2 ml/phút

cho thời gian lưu hợp lý, pic cân đối, có hệ đối xứng nằm trong khoảng cho

phép, thời gian lưu ngắn mà áp suất cột lại không cao.

Kết quả: lựa chọn pha động có tỷ lệ Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25

mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút.

3.1.4. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu

Tiến hành khảo sát thể tích tiêm mẫu ở 3 mức 20 µl, 40 µl, 50 µl.

Nhận xét: với thể tích tiêm mẫu là 20 µl cho pic đẹp, cân đối.

Kết luận: lựa chọn thể tích tiêm mẫu là 20µl.

Kết luận: từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:





Cột sắc ký: Eclipse XDB C18 (4,6ì150 mm, 5àm)







Detector: UV bc súng 362 nm







Pha động: Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0:



Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v)





Thể tích tiêm: 20 µl



26







Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút







Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm



Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Hòa tan 1,7 g kali dihydrophosphat

trong 400 ml nước. Điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric

và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].

Hình 3.7 là sắc ký đồ của felodipin thu được ở điều kiện sắc ký thiết lập

được



Hình 3.7. Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký)

3.2. Chuẩn bị mẫu

3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Cân chính xác khoảng 25,0 mg Felodipin chuẩn vào bình định mức dung

tích 25,0 ml, thêm khoảng 15,0 ml pha động, lắc cho tan, sau đó pha lỗng

bằng pha động đến vạch, lắc đều được dung dịch nồng độ 1 mg/ml.

- Pha dãy chuẩn:

Cho vào 5 bình định mức 50 ml các thể tích dung dịch felodipin nồng độ 1

mg/ml chính xác như bảng 3.3, pha lỗng bằng pha động đến vạch, lắc đều.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

27



Bảng 3.3. Cách pha các dung dịch chuẩn

STT



Bình định

mức

(ml)

50

50

50

50

50



1

2

3

4

5

Lọc qua màng 0,45 µm để chạy sắc ký.



Thể tích dung

dịch chuẩn

gốc (µl)

500

600

800

1000

1200



Nồng độ dự

kiến sau pha

lỗng (µg/ml)

10

12

16

20

24



3.2.2. Chuẩn bị dung dịch thử:

Cân chính xác khối lượng của 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung

bìnhviên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng

khoảng 5,0 mg felodipin (viên có khối lượng trung bình 354,60 mg) cho vào

bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml pha động, siêu âm 15

phút thêm pha động vừa đủ tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000

vòng/phút trong 5 phút. Lấy 10,0 ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0

ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, được dung

dịch thử.

3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng:

Là mẫu tá dược tự tạo bằng cách trộn theo nguyên tắc đồng lượng dựa vào

công thức của viên, không chứa dược chất được cân và xử lý mẫu giống mẫu

thử.

3.3. Thẩm định phương pháp HPLC định lượng felodipin

3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành: chuẩn bị mẫu felodipin chuẩn nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1.

Sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch này theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình

bày ở bảng 3.4.



28



Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Stt

1

2

3

4

5

6

TB

RSD%

Nhận xét:



Thời gian lưu

(phút)

7,273

7,154

7,051

7,280

7,281

7,175

7,203

1,29



Diện tích

pic(mAU.s)

398,6

396,2

397,9

396,6

396,8

399,0

397,5

0,29



Hệ số đối

xứng

0,959

0,994

0,996

0,988

0,990

0,997



Số đĩa lý

thuyết

8411

8293

8102

8664

8602

8463

8422,5



Kết quả ở bảng cho thấy RSD của thời gian lưu và diện tích pic của Felodipin

của 6 phép thử <2%,các giá trị đối xứng nằm trong khoảng cho phép 0,8 ≤ F≤

1,5 và số đĩa lý thuyết trung bình cao.

Điều này chứng tỏ hệ thống sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép

phân tích định lượng felodipin.

3.3.2. Tính đặc hiệu

− Chuẩn bị dung dịch chuẩn Felodipin nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1,

mẫu trắng như mục 3.2.3

− Tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả

thu được các sắc ký đồ như ở hình 3.8, 3.9.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

29



Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu trắng



Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml

Nhận xét: ở hình 3.9 cho thấy pic của felodipin có tR= 7,303 phút, pic cân đối

sắc nét

Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian

phân tích từ 7- 8 phút. Chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao.

3.3.3. Độ tuyến tính

Tiến hành: chuẩn bị một dãy chuẩn felodipin có nồng độ 10-12-16-20-24

µg/ml như mục 3.2.1, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích

pic đo được ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phương trình

hồi quy và hệ số tương quan r.



30



Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.10

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Nồng độ C

(µg/ml)

Diện tích pic

(mAU.s)

Kết quả



10,01



12,01



16,02



20,02



24,02



174,4



211,2



292,4



376,7



455,8



Phương trình hồi quy tuyến tính:

y=20,237x - 30,125

Hệ số tương quan tuyến tính: R=0,9999



500



Diện tích pic (mAU.s)



450

400

350

300

250

200

150

100

5



10



15



20



Nồng độ felodipin (µg/ml)



25



30



Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

và diện tích pic

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát,

diện tích pic thu được đáp ứng trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của

chúng,sự phụ thuộc thể hiện qua đường thẳng hồi quy tuyến tính (hình 3.10)

và hệ số tương quan R= 0,9999. Như vậy phương pháp có sự tương quan

tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát 10 - 24 µg/ml.



Ket-noi.com

Ket-noi.com kho

kho tai

tai lieu

lieu mien

mien phi

phi

31



3.3.4. Độ chính xác

a. Độ lặp lại

− Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.2.2 làm 6 mẫu.Tiến hành sắc ký, ghi lại

sắc ký đồ và tính nồng độ felodipin trong các dung dịch thử theo đường chuẩn

xây dựng được từ dãy chuẩn.

− Kết quả xác định độ lặp lại của kết quả định lượng được trình bày ở bảng

3.6.

b. Độ chính xác trung gian

Phân tích định lượng felodipin trong viên ở ngày tiếp theo. Tiến hành tương

tự như độ lặp lại trong ngày: phân tích 6 mẫu thử độc lập. Tính tốn nồng độ

chất thử theo đường chuẩn xây dựng được trong cùng ngày phân tích. Kết quả

xác định hàm lượng felodipin trong viên được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6. Kết quả xác định độ chính xác



STT

Độ lặp

lại



Độ

chính

xác

trung

gian



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12



Khối lượng

cân (mg)



Diện tích

pic

(mAU.s)



354,88

384,5

357,00

384,2

367,20

393,7

356,37

391,8

357,10

382,0

366,09

395,6

355,70

390,5

351,40

390,2

355,30

391,9

361,50

396,2

353,10

383,2

356,30

395,9

Gộp kết quả 2 ngày (n=12)



Hàm lượng

so với

lượng ghi

trên nhãn

(%)

102,36

101,68

101,12

103,72

101,11

101,88

105,81

107,02

106,31

105,62

104,61

107,09



Các giá trị

thống kê

(%)

TB=101,98

RSD%=0,96



TB=106,08

RSD%=0,88



RSD%=2,24



32



Nhận xét: kết quả ở bảng cho thấy:

Với điều kiện đã chọn, độ lặp lại của các kết quả định lượng trong mỗi ngày

phân tích cho RSD đạt được là 0,96% và 0,88% đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá

gộp kết quả 2 ngày cho RSD là 2,24 % nhỏ hơn 3%.

Kết luận: phương pháp có độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian

đáp ứng yêu cầu thẩm định với chế phẩm thuốc.

3.3.5. Độ đúng:

Tiến hành:

- Pha dãy chuẩn: chuẩn bị như mục 3.2.1

- Mẫu tự tạo: Cân lượng mẫu tá dược tương đương khối lượng bột chứa 5 mg

felodipin vào bình định mức 50,0 ml. Thêm chính xác khoảng 4 mg, 5 mg và

6 mg chất chuẩn felodipin vào bình, thêm 35 ml pha động. Siêu âm 15 phút,

bổ sung bằng pha động tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút

trong 5 phút. Lấy 10,0ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0 ml, thêm

pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Sắc ký theo các điều kiện đã chọn ở trên, tìm độ thu hồi của chất chuẩn. Kết

quả khảo sát độ đúng của phương pháp được trình bày ở bảng 3.7



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×