Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp tối ưu

Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp tối ưu

Tải bản đầy đủ - 0trang

Với nhiệt độ bắt cặp 56oC, các nồng độ primer khác nhau - NT A3, B3, C3, D3

đều cho sản phẩm PCR sáng rõ, band dày và khơng có band sản phẩm phụ (mức độ

4+).Do nồng độ primer 0,25µM thấp nên band sản phẩm hơi mờ hơn các nồng độ khác

(mức độ 3+).

Ở nhiệt độ bắt cặp 58oC, NT A4, C4 – với nồng độ primer0,25µM và 0,75 µM –

cho sản phẩm PCR có band sáng, khơng xuất hiện band sản phẩm phụ (mức độ 3+).

Với NT B4, D4 - nồng độ primer 0,5 µM và 1µM, ta được sản phẩm PCR có band sáng

rõ, dày (mức độ 4+).

Từ các kết quả trên, cho thấy NT B3 - nhiệt độ bắt 56oC và nồng độ primer tối ưu

0,5µM, là tốt nhất cho quy trình PCR phát hiện H. parasuis (nồng độ primer thấp, tiết

kiệm hóa chất nhưng vẫn đảm bảo band sản phẩm sáng rõ, đúng kích thước chuẩn của

vi khuẩn H. parasuis, đồng thời khơng có band sản phẩm phụ). Quy trình tối ưu này

được dùng cho việc thử nghiệm tiếp theo.

L



(-)



A1



B1



C1



D1



821 bp

500bp



Hình 4.1 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 52 oC

A1: nồng độ primer 0,25 μM B1: nồng độ primer 0,5 μM

C1: nồng độ primer0,75 μMD1: nồng độ primer 1.0 μM

L:ladder (-) đối chứng âm



31



L



(-)



A2



B2



C2



D2



821 bp

500 bp



Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 54 oC

A2: nồng độ primer 1.0μM B2: nồng độ primer 0,75 μM

C2: nồng độ primer0,5 μMD2: nồng độ primer 0,25 μM

L:ladder (-) đối chứng âm.



L



(-)



A3



B3



C3



D3



821 bp

500bp



Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 56 oC

A3: nồng độ primer 0,25 μM B3: nồng độ primer 0,5 μM

C3: nồng độ primer0,75 μM D3: nồng độ primer 1.0 μM

Lladder (-) đối chứng âm.



32



L



(-)



A4



B4



C4



D4



821 bp

500 bp



Hình 4.4 Kết quả khảo sát nồng độ primer ở 58 oC

A4: nồng độ primer 1.0μM B4: nồng độ primer 0,75 μM

C4: nồng độ primer0,5 μM D4: nồng độ primer 0,25 μM

L:ladder (-) đối chứng âm.

4.3 Kết quả xác định nồng Master mix tối ưu

Dựa vào kết quả thí nghiệm 4.2, chọn NT B3 vớinồng độ primer 0,5μM và nhiệt

độ bắt cặp 56oC thực hiện phản ứng PCR trên mẫu đối chứng dương lần lượt với các

nồng độMaster mix 6μl, 8μl, 10μl.

Theo kết quả trên gel điện di Hình 4.5, cả ba nồng độ Master mix khảo sát đều

cho kết quả đặc hiệu, thu được band sản phẩm mong muốn 821bp sáng và rõ nét. Nồng

độMaster mix 6µl cho band mờ hơn, nồng độ 8µl và 10µl cho band sản phẩm dày, sáng

rõ gần như ngang nhau nên nồng độ Master mix 8µl là nồng độ tối ưu được sử dụng

(do tiết kiệm hóa chất nhưng vẫn đạt yêu cầu sản phẩm PCR có band sáng rõ, dày,

khơng xuất hiện band sản phẩm phụ).



33



L



(-)



1



2



3



821bp

500bp



Hình 4.5 Kết quả khảo sát nồng độ Master mix

(1) nồng độ 6 μl (2) nồng độ 8 μl (3) nồng độ 10 μl

(-) đối chứng âm(L) ladder.

4.4 Kết quả giải trình tự gen sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR sau khi điện di trên agarose 1.5% đã thu được vạch DNA với kích

thước 821 bp như mong muốn. Tuy nhiên, chưa thể kết luận đây là DNA lồi H.

parasuis. Do đó phương pháp giải trình tự gen được áp dụng để kiểm chứng sản phẩm

PCR này.

Đoạn trình tự nucleotide sau khi giải (Cơng ty Nam Khoa) được tiến hành kiểm

tratrên Genbank bằng công cụ BLAST của NCBI, kết quả trình bày theo độ tương đồng

giảm dần, trong 100 trình tự có độ tương đồng cao nhất với đoạn gen cysS có 85 trình

tự tương đồng 100% và 15 trình tự tương đồng 99%.



34



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Kết quả xác định nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp tối ưu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×