Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Mục tiêu và yêu cầu

Mục tiêu và yêu cầu

Tải bản đầy đủ - 0trang

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis gây ra

2.1.1 Khái niệm

H. parasuislà vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấpxảy ra trên

heo ở mọi lứa tuổi, nguyên nhân gây nên bệnh Glasservới cácdấu hiệu lâm sàng bao

gồm sốt, chán ăn, sưng khớp với sự di chuyển khó khăn, khó thở và các dấu hiệu

thần kinh. Bệnh tích đặc trưng do xâm nhiễm có hệ thống, nhiễm khuẩn huyết và

hậu quả là gây ra hội chứng “polyserositis” (viêm đa xoang dạng sợi huyết có mủ,

viêm phúc mạc, viêm màng ngoài tim, viêm màng phổi, viêm màng não và viêm

khớp).

2.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Bệnh do H. parasuis đã được Glasser phát hiện đầu tiên vào năm 1910, trên

heo bệnh có biểu hiện viêm đa khớp – viêm thanh dịch. Năm 1931, vi khuẩn được

phân lập từ heo bị cúm và được đặt tên Haemophilus influenzae suis. Đến năm

1943, bệnh đã được Hiare và Wramby nghiên cứu về căn bệnh và đặt tên

làHaemophilus suis.Sau đó, vào năm 1976, qua những nghiên cứu đáng tin cậy, vi

khuẩn được đặt tên như hiện nay là Haemophilus parasuis.Ngoài ra theo Tơ Minh

Châu và Trần Thị Bích Liên (2001) trước đó căn bệnh do Haemophilus đã được

Pleiffer phân lập lần đầu tiên trong những bệnh phẩm từ bệnh nhân bị cúm trong

thời gian có dịch cúm vào năm 1892. Đến 1918 người ta mới phát hiện ra chúng là

những nguyên nhân thứ hai sau virus cúm và thường xuyên xuất hiện cùng với virus

cúm ở heo. Bệnh xảy ra ở hầu hết đàn heo trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh có thể lên

đến 100% nhưng tỉ lệ chết dao động từ 5 – 10%.H. parasuis là nguyên nhân gây

viêm phổi và viêm đa thanh mạc (viêm màng phổi, viêm màng bao tim, viêm

khớp,…kèm sợi huyết) trên heo.



3



2.1.3 Đặc điểm của Haemophilus parasuis

H. parasuislà vi khuẩn có hình trực khuẩn, Gram âm, có tiêm mao và giáp mơ,

hiếu khí hay yếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH 7,4–7,8. Khác với

những loài Haemophilus khác, sự phát triển của H. parasuis chỉ cần yếu tố V

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide – NAD) mà không cần yếu tố X (Hemin).15

serovar của H. parasuis đã được xác định, serovar 4 và 5 được phân lập nhiều nhất.



Hình 2.1 Nhuộm Gram vi khuẩn H. parasuis

(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Vi khuẩn có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông

thường, nhạy cảm với sự khô hạn và ánh sáng mặt trời.

2.1.4 Dịch tễ học

H. parasuis gây viêm màng phổi, viêm phế quản phổi, viêm đa thanh dịch trên

heo, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống và sức tăng trọng của heo. Căn

bệnh lây lan khá mạnh, việc lây truyền có thể qua tiếp xúc trực tiếp, qua những giọt

khí dung và cũng có thể lây truyền gián tiếp qua cơng nhân trong trại. Bệnh cấp tính

có thể xảy ra ở nhiều ơ chuồng, do khí dung và khơng khí chuyển động làm lan

truyền mầm bệnh, chỉ cần một lượng nhỏ H. parasuis khoảng 102-104tế bào cũng đủ

để gây nhiễm.



4



Miễn dịch từ mẹ truyền giảm sau 2-4 tuần, vì vậy thời kỳ này bệnh có thể xảy

ra trên heo 2-15 tuần, nhưng heo thời kỳ cai sữa 5-8 tuần tuổi thường mắc phải, tỷ lệ

tử vong là 5–10% nhưng có thể lên tới 50%. Vi khuẩn có nhiều serovar nên có thể

có nhiều hơn một serovar gây bệnh cho một đàn và có nhiều serovar khơng độc lực

ở mũi heo. Miễn dịch thường chỉ chống với serovars nhiễm, đối với serovar khác thì

khơng có, hoặc nếu có thì cũng rất kém.

2.1.5 Cơ chế sinh bệnh

Các yếu tố gây stress như thay đổi thời tiết đột ngột, ẩm độ cao kết hợp với độ

thơng thống kém, vận chuyển, thay đổi thức ăn, cai sữa,.. là những yếu tố mở

đường cho bệnh phát triển nhanh. Bệnh phát triển mạnh trên đàn heo khi thời tiết

khắc nghiệt.H. parasuis định cư ở xoang mũi và khí quản mà khơng gây bệnh hoặc

ở dạng độc lực yếu làm hư hại lông rung và phá hủy tế bào biểu mô.

Sau khi xâm nhập qua đường hô hấp vào phổi, vi khuẩn cư trú và nhân lên ở

phế nang, sau 12 giờ vi khuẩnbị thực bào nhanh chóng bởi đại thực bào phế nang và

sản sinh độc tố dung giải tế bàovào máu và gây nhiễm trùng huyết, H. parasuis đặc

biệt ưa thích phát triển trên bề mặt màng thanh dịch (màng bụng, màng phổi, màng

ngoài tim, màng não, khớp) và hậu quả là gây viêm thanh dịch, viêm dính sườn,

viêm màng phổi sợi huyết, viêm màng não có mủ,… Khi nhiễm qua đường phế

quản có thể gây viêm khí quản phổi, H. parasuis nhân lên ở niêm mạc phế quản hơn

là tế bào có tiêm mao đường hơ hấp.

2.1.6 Triệu chứng

Triệu chứng bệnh có thể thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm

của thú, môi trường và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh.Triệu chứng bệnh xuất

hiện rất sớm sau khi nhiễm với biểu hiện sốt và suy hô hấp.

Thể cấp tính bệnh có thể xảy ra trên heo 5-8 tuần tuổi, ở một hay nhiều heo

trong cùng một bầy hoặc khác bầy thú đột nhiên yếu ớt, sốt với thân nhiệt 4041,5oC. Heo bỏ ăn, có triệu chứng hơ hấp, ho, khó thở, thở thể bụng, nhịp tim tăng

(160 nhịp/phút) đặc biệt heo bị khập khiễng hoặc ngồi kiểu chó (tư thế ngồi để dễ



5



thở). Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào não, màng não, tủy sống sẽ gâyrối loạn thần kinh

hầu với các biểu hiện co giật, mất vận động, sau cùng là ngã vật xuống, nằm

nghiêng sang một bên.Hầu hết các khớp đều sưng phồng và đau đớn, đi lại khó

khăn, có thể thấy thủy thũng ở mi mắt, ở tai và mặt. Thú sẽ chết trong vòng 2-5

ngày, heo chết thường có biểu hiện đỏ đến tím xanh trên da.

Ở thể mãn tính, bệnh sẽ phát triển khi biểu hiện bệnh cấp tính biến mất sau 5

ngày, những heo sống sót sẽ chuyển qua viêm khớp mãn tính, viêm nội tâm mạc,

viêm dính ruột, viêm màng não. Heo mãn tính có thể chết đột ngột.



Hình 2.2 Triệu chứng lâm sàng của heo nhiễm H. parasuis: thở khó,

ngồi kiểu chó, khớp sưng, xuất huyết trên da

(Nguồn: Bùi Thị Hương Linh, 2013)

2.1.7 Bệnh tích

Thể cấp tính: Khí quản, phế quản chứa đầy chất nhầy, phổi bị phù và xuất

huyết, biểu hiện rõ viêm màng phổi nhiều sợi huyết, viêm kẽ, thủy thũng, viêm dính

giữa phổi và thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim, xoang ngực chứa đầy dịch



6



viêm. Ngồi ra, có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm khớp có dịch khớp đục, viêm

màng não cũng thường xảy ra.



Hình 2.3 Viêm phổi sợi huyết trong bệnh Glasser

(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)

Thể mãn tính: thường xuất hiện với những dạng bệnh tích kết dính có sợi

huyết, viêm màng ngoài tim cùng với biểu hiện suy tim, thủy thũng phổi, xoang

ngực chứa nhiều dịch.



7



Hình 2.4 Viêm phúc mạc và viêm màng ngồi tim sợi huyết

(Nguồn: Theo Virginia Aragón, 2009)



Hình 2.5 Dịch màng bao tim đục và có sợi huyết ở màng ngoài tim

(Nguồn: Tổ chức Hợp tác Quốc tế Nhật Bản, 2001)



8



2.2 Polymerase chain reaction (PCR)

2.2.1 Định nghĩa phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khn là một

trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượngbản sao của khuôn này thành

hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym DNApolymerase và một cặp primer

đặc hiệu cho đoạn DNA này. Nhờ enzym DNApolymerase xúc tác trên các mạch

khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Cácmạch đơn mới được tổng hợp lại

được sử dụng làm khn cho q trình tổng hợpmạch mới của chu kỳ tiếp theo. Sự

tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của các primer tạo các nhóm 3’

OH tự do. Các nucleotid được gắn ở vị trí nhóm OHkéo dài tạo thành mạch đơn

mới (Khuất Hữu Thanh, 2006).

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Giai đoạn biến tính (denaturation): nhiệt độ được nâng lên 95oC. Liên kết

hydro bị phá vỡ, các đoạn xoắn kép của DNA đều được tách ra, DNA biến tính từ

mạch đơi thành mạch đơn. Có thể biến động trong khoảng từ 93 – 100oC.

Giai đoạn bắt cặp (hybridization): hạ nhiệt độ phản ứng xuống (thấp hơn

nhiệt độ nóng chảy Tmcủa primer được sử dụng) cho phép các primer tìm kiếm và

bắt cặp bổ sung đặc hiệu với DNA khuôn mẫu, dao động vào khoảng 40 – 70oC, tùy

thuộc Tmcủa các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.

Giai đoạn kéo dài (extention): nâng nhiệt độ lên 72oC đểTaq-polymerase hoạt

động tổng hợp tốt nhất, kéo dài các mạch DNA.Taq-polymerase sẽ lấy các dNTP từ

môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của primer theo nguyên tắc bổ sung với

trình tự DNA đích. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA

mẫu, thường kéo dài từ 1 giây đến nhiều phút.



9



Hình 2.6 Một chu trình phản ứng PCR

Giai đoạn 1: Biến tính ở 94oC/1 phút

Giai đoạn 2: Bắt cặp ở 54oC/45 giây

Giai đoạn 3: Kéo dài ở 72oC/2 phút

(Nguồn: Ghent University, 1999)

Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Đây là sự

nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với

n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.



10



2.2.3 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR

2.2.3.1



Primer



Primer là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide),cần thiết cho việc xúc tiến

phản ứng dây truyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA

mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các primer này có chiều ngược nhau, bao gồm

một primer xi (F: forward) và một primer ngược (R: reverse). Xuôi và ngược là

so với chiều sao mã.

Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến

hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR.Chọnprimer là giai đoạn quyết

định của phản ứng PCR, cần tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: trình tự của

primer được chọn sao cho khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa hai primer hay giữa

một primer với chính nó (trình tự của chúng khơng được bổ sung nhau); Tm của

haiprimer không quá cách xa nhau; thành phần nucleotic củaprimer cần tránh các

cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự DNA

cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại trên gene; trình tự giữa hai primer

khơng q lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb,

kích thước khoảng 18 – 24 base (Phan Cự Nhân, 2001).

2.2.3.2



DNA bản mẫu (DNA template)



Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế

phản ứng: SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin…). PCR vẫn cho

kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được

bảo quản tốt.

2.2.3.3



Nồng độ MgCl2



Nồng độ MgCl2 là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR, cần cho hoạt

động của Taq-polymerase. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng

thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 – 5 mM. Nồng độ MgCl2từ 1,5 – 2 mM được



11



xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua

nhiều thí nghiệm (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).

Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kiềm hãm sự biến tính

hồn tồn các sợi đơi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg2+còn làm cho hiện

tượng bắt cặp không đặc hiệu xảy ra nhiều hơn,hiện tượng này làm primer bắt cặp ở

những vị trí khơng chun biệt trên DNA khuôn tạo ra các sản phẩm không mong

muốn với số lượng lớn.

Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5 mM) thì quá trình kéo dài xảy ra

khơng hồn tồn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do

trong phản ứng PCR, Mg2+đóng vai trò Co-factor của Taq-polymerase nên nếu

lượng Mg2+q thấp thì Taq-polymerase sẽ khơng hoạt động bình thường trong giai

đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lan, 1999).

2.2.3.4



dNTPs



Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4

loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200μM

cho mỗi nucleotide.

Điều quan trọng là thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng

thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.

2.2.3.5



Taq-polymerase



Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối

nước nóng có tên Thermus aquaticus do nhà vi sinh vật học Thomas Brock phát

hiện. Taq-polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và

hoạt động tối ưu ở 68 –72oC.

Nồng độ enzyme Taq-polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn

vị trên 100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản

phẩm khơng chun biệt, làm sai lệch kết quả. Nếu nồng đọ Taq quá thấp, phản ứng



12



sẽ khơng có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn.

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

2.2.3.6



Số chu kỳ trong phản ứng PCR



Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu.

Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng ban mẫu

là 102 – 103 thì số chu kỳ là 35 – 40.

Trong thực tế, không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho một phản ứng PCR,

vì phản ứng PCR diễn biến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng

lên theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những

nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; Sự xuất

hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng; Các bản sao vừa được tổng hợp không kết

hợp với primer mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001).

2.2.4 Đọc kết quả phản ứng PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.

Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính cấu trúc DNA. DNA là

các đại phân tử điện tích âm, DNA sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường.

Dưới tác động của điện trường, sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ

thuộc vào khối lượng phân tử (số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel,

điện thế của điện trường. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc

thẳng đứng. Để nhận biết phân tử DNA di chuyển đến đâu trong bản gel, người ta

có thể sử dụng một dung dịch có màu (loading dye) được nhuộm chung với sản

phẩm PCR khi cho chúng vào những lỗ nhỏ trên gel (gọi là giếng-well). Trong một

số dung dịch đệm vẫn có thể có màu, khi đó khơng cần dùng đến loading dye.

Trong quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử DNA

và ta có thể nhìn thấy một vạch dài có màu này. Sau khi điện di, bản gel sẽ được

nhuộm với dung dịch ethidium bromide. Ethidium bromide có khả năng gắn xen

giữa các base của nucleic. Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV

(bước sóng λ=300nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí



13



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Mục tiêu và yêu cầu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×