Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
4 Phương pháp nghiên cứu

4 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ - 0trang

Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu máu bò sữa và heo thịt cho khảo sát

Tổng đàn (con)



Số mẫu xét nghiệm



Quận/ Huyện



Bò sữa



Heo thịt



Bò sữa



Heo thịt



Củ Chi



54.200



106.226



276



350



Hóc Mơn



24.695



29.782



104



142



Tổng



78.895



136.008



380



492



(Nguồn: CCTY TP.HCM, 2013)



3.4.4 Phương pháp xét nghiệm

3.4.4.1 Nguyên tắc



Sử dụng kỹ thuật “ELISA kẹp chả” để phát hiện kháng thể kháng vi-rút

LMLM týp O. Nguyên tắc của kỹ thuật này như sau:

Sử dụng kháng huyết thanh thỏ đặc hiệu kháng lại vi-rút LMLM týp O được

gọi là kháng thể bắt giữ vào các giếng polystyrene (đĩa phản ứng).

Kháng nguyên LMLM týp O đặc hiệu vô hoạt và huyết thanh thú xét nghiệm

được pha loãng 1/25 kết hợp với nhau. Nếu trong huyết thanh thú có kháng thể

chống vi-rút LMLM týp O thì sẽ tao thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể làm

giảm lượng kháng nguyên tự do và tùy lượng kháng thể trong huyết thanh mà lượng

kháng nguyên tự do trong hỗn hợp nhiều hay ít.

Cho hỗn hợp kháng nguyên – huyết thanh vào đĩa phản ứng và lượng kháng

nguyên tự do còn lại sẽ gắn với kháng thể dưới đáy giếng và được giữ lại sau khi

rửa giếng.

Khi cho kháng thể chuột lang đặc hiệu kháng vi-rút LMLM týp O vào giếng

phản ứng. Nếu có kháng ngun thì kháng thể sẽ gắn với kháng nguyên và được giữ

lại sau khi rửa giếng.

Cho cộng hợp (là conjugate gồm kháng thể chuột lang có gắn enzyme

horse – radish peroxidase HPR) vào giếng phản ứng và được giữ lại nếu có kháng

thể chuột lang và sẽ tạo màu quan sát được khi cho kết hợp với dung dịch cơ

chất/chất tạo màu (substrate/chromogen).



23



Tùy vào lượng kháng nguyên mà màu quan sát được sẽ có mức độ đậm, nhạc

khác nhau khi so sánh với các mẫu đối chứng chỉ chứa kháng nguyên tự do (cường

độ màu được đọc bằng máy ELISA với bước sóng 492 nm. Màu càng đậm chứng tỏ

lượng kháng nguyên tự do càng nhiều và ngược lại.

Kháng thể kháng vi-rút

LMLM chế từ thỏ



Kháng thể

trong huyết

thanh xét

nghiệm ủ với

kháng nguyên

gốc (vi-rút

LMLM týp O)



Ủ qua đêm 4 – 8 oC



Cho kháng thể kháng vi-rút

LMLM được chế từ chuột lang



Cho conjugate (kháng thể thỏ

kháng lại kháng thể chuột lang

có gắn enzyme)



E



E

Nếu có kháng thể chuột lang thì

conjugate sẽ được giữ lại



E



E



Cho chất tạo màu phản ứng

vào. Tùy hàm lượng kháng

nguyên có mặt mà mức độ

hiện màu khác nhau.



Hình 3.1 Hình vẽ minh họa cơ chế phản ứng “ELISA kẹp chả”

phát hiện kháng thể kháng vi-rút LMLM



24



Xét nghiệm được tiến hành trên vỉ 96 giếng với các mẫu huyết thanh dùng để xét

nghiệm và đối chứng được bố trí theo Bảng 3.2

Bảng 3.2 Phân bố vị trí mẫu huyết thanh và đối chứng cho xét nghiệm

A



1

C++



2

C++



3

1



4

1



5

9



6

9



B



C++



C++



2



2



10



10



C



C+



C+



3



3



D



C+



C+



4



4



E



C-



C-



5



5



F



C-



C-



6



6



G

H



Ca

Ca



Ca

Ca



7

8



7

8



7



8



9



10



11



12



39

40



39

40



Ghi chú:

A1, A2, B1, B2: đối chứng huyết thanh dương mạnh (viết tắt C++).

C1, C2, D1, D2: đối chứng huyết thanh dương yếu (viết tắt C+).

E1, E2, F1, F2 : đối chứng huyết thanh âm (viết tắt C-).

G1, G2, H1, H2 : đối chứng kháng nguyên (viết tắt Ca).

A3, A4 : huyết thanh kiểm tra 1.

B3, B4 : huyết thanh kiểm tra 2.

………………………………..

H11, H12: huyết thanh kiểm tra 40.

3.4.4.2 các bước tiến hành (xem phụ lục)

3.4.4.3 Tính tốn kết quả

PI (%) = 100 – [(OD TB mẫu x 100) /Trung vị của ODCa)]

Ghi chú:

PI (%): phần trăm ức chế

OD TB mẫu: OD trung bình mẫu.

OD Ca: OD của đối chứng.

Trung vị OD Ca: giá trị trung bình giữa giá trị nhỏ nhất và lớn nhất của OD Ca.



25



Đánh giá kết quả: mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể đủ bảo hộ

chống vi-rút LMLM khi có giá trị PI ≥ 50 % và hiệu giá kháng thể ≥ 112 (theo tiêu

chuẩn bộ kít “ELISA kit for FMDV serolory (týp O)” của Pirbright laboratories

(Anh)).

Cơng thức tính:Tỷ lệ bảo hộ (%) = (số mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo

hộ/tổng số mẫu huyết thanh khảo sát) x 100



Hình 3.2 Xét nghiệm ELISA trên vỉ 96 giếng



26



3.5 Chỉ tiêu theo dõi

3.5.1 Đối với mẫu huyết thanh bò sữa

Tỷ lệ mẫu huyết thanh bò sữa có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo địa bàn khảo sát.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh bò sữa có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo quy mô chăn nuôi.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh bò sữa có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo lứa tuổi.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh bò sữa có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo thế hệ lai.

3.5.2 Đối với mẫu huyết thanh heo thịt

Tỷ lệ mẫu huyết thanh heo thịt có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo địa bàn khảo sát.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh heo thịt có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo quy mô chăn ni.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh heo thịt có kháng thể đủ bảo hộ đối với vi-rút LMLM

týp O theo lứa tuổi.

3.6 Xử lý số liệu

Bảng biểu và biểu đồ được trình bày bằng phần mềm Excel 2007.

Các tỷ lệ được so sánh bằng trắc nghiệm Chi – Square thuộc phần mềm

Minitab 16.



27



Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong quá trình khảo sát từ tháng 02/2013 đến tháng 06/2013 chúng tôi đã sử

dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ hay

khơng? Nếu mẫu huyết thanh có kết quả PI (% ức chế) lớn hơn hoặc bằng 50 % sẽ

kết luận là có đủ kháng thể bảo hộ (theo tiêu chuẩn bộ kít “ELISA kit for FMDV

serolory (týp O)” của Pirbright laboratories (Anh)).

4.1 Kết quả khảo sát trên bò sữa

4.1.1 Nhận xét chung về tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ trên bò sữa

sau khi tiêm phòng vắc-xin LMLM týp O

Để đánh giá hiệu quả tiêm phòng và kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng vi-rút

LMLM týp O trên các mẫu huyết thanh bò sữa, chúng tơi đã tiến hành lấy mẫu và

thực hiện xét nghiệm 380 mẫu huyết thanh của đàn bò sữa đã được tiêm phòng

vắc-xin LMLM týp O trước đó. Kết quả thu được là có 353 mẫu đủ bảo hộ, chiếm

tỷ lệ 92,89 %. Tỷ lệ này đã đạt yêu cầu bảo hộ quần thể do CCTY TP.HCM quy

định (≥ 80 %).

So sánh kết quả của chúng tôi (2013) với kết quả những năm gần đây về tỷ lệ

bảo hộ trên bò sữa sau tiêm phòng vắc-xin LMLM týp O trên cùng địa bàn khảo sát

(Củ Chi, Hóc Môn) (Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1).

Bảng 4.1 Tỷ lệ bảo hộ chung trên bò sữa giai đoạn 2011 – 2013

ở Củ Chi và Hóc Mơn

Năm

2011(*)

2012(*)

2013



Số mẫu

xét nghiệm

101

80

380



Kết quả xét nghiệm

Số mẫu

Tỷ lệ

dương tính

dương tính (%)

86

85,15

75

93,75

353

92,89



(Ghi chú: (*) nguồn: CCTY TP.HCM, 2011, 2012)



28



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

4 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×