Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tải bản đầy đủ - 0trang

Tủa acid nucleic nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, bảo vệ chúng

khỏi sự phân hủy của các enzyme và để hòa tan chúng trong dung dịch theo nồng độ

mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là:

Tủa trong ethanol: được thực hiện với mơi trường có lực ion cao (nồng độ

muối cao) và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích ethanol/l dung tích mẫu). Nhiệt độ

thấp sẽ thuận lợi cho việc tủa.

Tủa trong isopropanol thì khơng cần có sự hiện diện của muối, thể tích

isopropanol:thể tích mẫu là 1:1. Các DNA có trọng lượng thấp khơng bị tủa nên có

thể loại chúng ra khi tủa bằng cách này.

Sau đó, DNA sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Cặn tủa phải được rửa trong

ethanol 70 % để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại.

2.3.3 Định tính và định lượng DNA

Để định tính DNA người ta thường điện di trên gel agarose hay

polyacrylamid, làm chúng hiển thị trực tiếp dựa trên các đặc tính cấu trúc của acid

nucleic. Tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém nên ít dùng mà chỉ định lượng

DNA.

Định lượng DNA bằng quang phổ kế là phương pháp ước lượng tương đối

nồng độ DNA có trong mẫu ly trích. Ngun tắc của phương pháp này dựa vào sự

hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine.

Giá trị mật quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm – optical density) của các mẫu đo

cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị

OD260nm tương ứng nồng độ là 50 µg/ml cho dung dịch DNA. Ví dụ, một giá trị =

0,9 sẽ tương ứng với dung dịch có nồng độ DNA = 0,9*50 = 45 µg/ml (Hồ Huỳnh

Thùy Dương, 1998).

Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với các dung dịch DNA sạch. Để kiểm tra

độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm), là bước

sóng mà ở đó các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các DNA

và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ DNA. Một dung dịch được xem là

sạch khi tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2.



18



2.3.4 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR

DNA khuôn mẫu (template).

Mồi xuôi và mồi ngược.

Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq). Đây

là một enzyme có tính ổn định ở nhiệt độ cao, thời gian bán rã hơn 130 phút ở nhiệt

độ 92,5 0C và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.

Các dNTPs (deoxynucleoside triphosphate) là hỗn hợp 4loại: dATP, dTTP,

dCTP, dGTP cung cấp năng lượng và base trong quá trình phản ứng.

Dung dịch đệm thích hợp cho phản ứng PCR, MgCl2.

2.3.5 Primer

Là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base

(18 - 30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết

thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn. Trong

thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính:

Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn

càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà khơng

thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngồi chuỗi đích, thì sản phẩm PCR

càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu.

Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp

sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó

xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đơi.

Thơng thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là

primer set, trong đó có một mồi xi gọi là up-stream primer và một mồi ngược gọi

là down-stream primer. Cặp mồi này quyết định nên kích thước của sản phẩm PCR.

Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm

PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước của

sản phẩm PCR càng nhỏ bấy nhiêu.



19



2.3.6 Nguyên tắc của phương pháp PCR

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ

mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Đoạn acid nucleic

mong muốn được phát hiện bởi 2 đoạn mồi chuyên biệt: mồi xuôi (upstream 5’

primer) và mồi ngược (downstream 3’ primer).

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ

gồm 3 bước:

Bước 1: phân tử DNA bị biến tính để hình thành dây DNA mở xoắn, thường

là ở 94 - 95 0C trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính.

Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ

này dao động khoảng 40 - 60 0C và kéo dài 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai.

Bước 3: nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 0C giúp cho DNA polymerase tác

dụng, vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc

vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều

phút. Đây là giai đoạn kéo dài.

Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp

lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số

nhân.

2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

 DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ

thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu thập từ dịch chiết tế

bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm với việc sử dụng các

polymerase cho hiệu quả cao hơn. Hơn nữa việc giảm mẫu ban đầu còn hạn chế

được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ

Huỳnh Thùy Dương, 1998).

 Enzyme

Taq polymerase (DNA polymerase) không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và

xúc tác từ đầu đến cuối q trình phản ứng. Nồng độ Taq q cao có thể tham gia



20



vào việc làm sai lệch các kết quả. Ngược lại, nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ

không đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu

và Nguyễn Thị Lang, 1999).

Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép

DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease

3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa

sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra

trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung

cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA

 Primer và nhiệt độ lai

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng

và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của kỹ thuật PCR và phải

tuân theo một số nguyên tắc:

Trình tự mồi chọn sao cho khơng thể có sự bắt cặp bổ sung giữa các thành

phần khác nhau của mồi.

Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không tách biệt nhau quá xa. Thành

phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp C-G lặp đi lặp lại nhiều lần.

Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng

trùng với các trình tự lặp lại trên gen.

Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và mồi “ngược” không nên quá lớn, phản

ứng PCR sẽ tối ưu hóa khi đoạn gen được tổng hợp có kích thước nhỏ hơn 1 Kb

(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).

 Các thành phần khác của phản ứng PCR

Deoxynucleoside triphosphate (dNTPs)

Bốn dNTPs được sử dụng cho PCR khoảng chừng 100 mM/mồi nucleotide

bao



gồm:



triphosphate),



dATP

dGTP



(deoxyadenosine



triphosphate),



(deoxyguanosine



triphosphate),



triphosphate).

Tuy nhiên nồng độ dNTPs phụ thuộc vào:



21



dCTP

dTTP



(deoxycytosine

(deoxythimine



Nồng độ MgCl2.

Nồng độ mồi.

Độ dài của đoạn cần khuếch đại.

Số chu kỳ PCR.

Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong

thành phần nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.

Dung dịch đệm cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ ion Mg2+ cũng là

nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR. Trong phản ứng có sự tương tác giữa

dNTPs và MgCl2. Nếu nồng độ dNTPs cao thì nồng độ MgCl2 sẽ tăng lên.

 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ qua hai giai đoạn: Giai

đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu,

sau đó hiệu quả giảm hẳn vì nhiều nguyên nhân:

Sự phân hủy và cạn kiệt của các thành phần phản ứng.

Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.

Các bản sao vừa được tổng hợp không kết với mồi mà bắt cặp với nhau.

 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng

Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt

độ thật nhanh và chính xác. Tuy nhiên, vì mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên

mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên một loại thiết bị. Ống

nghiệm dùng cho hết các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì

đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo

nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến q trình khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy

Dương, 1998).

2.3.8 Các hạn chế của PCR

Do độ nhạy rất cao của kỹ thuật PCR, đồng thời với những thao tác rất đơn

giản nên người ta sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên,

kỹ thuật này còn nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng trong q trình thực

nghiệm. Ba điều cần lưu ý khi sử dụng kỹ thuật PCR:



22



Kích thước và trình tự cần giới hạn. Trừ vài trường hợp cá biệt, PCR không

hoạt động được với những đoạn DNA có kích thước lớn hơn 3 Kb. Việc sử dụng

PCR với đoạn DNA có độ dài dưới 1,5 Kb sẽ cho kết quả tốt.

Sự ngoại nhiễm cũng được đề cập vì nó gắn liền với khả năng khuếch đại

bản sao của kỹ thuật này. Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn

đốn dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất có

thể là những sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng

minh rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng

khơng gian kín như phòng thí nghiệm sẽ làm cho các phân tử đã được khuếch đại

thốt ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong khơng khí và bám vào tường, cửa, thiết

bị và dụng cụ trong phòng thí nghiệm… Rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau

đó.

Các sai sót do Taq polymerase gây ra. Việc sao chép bởi Taq polymerase cho

tỉ lệ sai số khá cao 10-4 (nghĩa là cứ 1000 nucleotide thì enzyme sẽ gắn sai 1

nucleotide).Vì vậy ta phải xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm

khuếch đại. Điều này có ý nghĩa rất lớn nếu cần xác định trình tự nucleotide của

DNA.

2.3.9 Giá trị sử dụng của PCR

Kỹ thuật này có ý nghĩa rất lớn vì:

Thời gian thực hiện nhanh, chỉ mất khoảng 3 giờ để khuếch đại một trình tự

DNA cần quan tâm.

Đơn giản và ít tốn kém do được thực hiện trong các ống plastic nhỏ gồm các

thành phần tối thiểu được sử dụng.

2.3.10 Đọc kết quả

Để kết quả sau khi điện di đạt kết quả tốt người ta thường chon loại gel và

nồng độ tương ứng với trình tự đoạn DNA cần phân tách. Hai loại gel thường được

sử dụng là gel agarose và gel polyacrylamid.



23



2.4 Những cơng trình nghiên cứu có liên quan

Schuchert J. A và ctv (2004) nghiên cứu kỹ thuật multiplex PCR phát hiện và

xác định APP và các týp 1, 2, 5, 8.

Quách Thanh Sinh (2005) khảo sát 4 phương pháp chẩn đốn APP dựa vào

bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể, ni cấy phân lập và ELISA trên mẫu phổi heo

giết mổ tại cơ sở giết mổ Nam Phong TP.HCM. Trong 261 mẫu phổi có bệnh tích,

60 mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do APP được thu thập, chọn 10 mẫu huyết thanh

trên heo tương ứng để xét nghiệm ELISA và 10 mẫu phổi để cắt vi thể. Kết quả cho

thấy rằng 22,98% mẫu phổi nghi ngờ APP qua quan sát bệnh tích đại thể, trong đó

chỉ có 3,33% phân lập được vi khuẩn. Tác giả cũng cho rằng nên phối hợp của 4

phương pháp này để chẩn đoán APP.

Tại Nhật Bản, Ohba và ctv (2009) thực hiện một cuộc khảo sát bệnh tích đại

thể trên 14.818 heo giết mổ và thu thập 25 mẫu phổi có bệnh tích viêm phổi – màng

phổi nghi ngờ có liên quan đến APP để phân lập. Và kết quả chỉ phát hiện APP

serotype 2 trên 20 mẫu (80%).

Hricinova và ctv (2010) đã phát triển phương pháp mutiplex PCR để xét

nghiệm đồng thời các tác nhân gây bệnh quan trọng trên heo như

A.pleuropneumoniae, P.multocida và H. parasuis ở Slovania. Bên cạnh đó, nhóm

tác giả cũng sử dụng phương pháp ni cấy phân lậpvi khuẩn để so sánh với

phương pháp mutiplex PCR. 219 mẫu phổi heo được thu thập từ lò mổ và kiểm tra

bằng 2 phương pháp trên. Trong tổng số 219 mẫu phổi, có 164 mẫu dương tính với

P. multocida (74,9%), 45 mẫu dương tính với A. pleuropneumoniae (20,5%) và 4

mẫu dương tính với H. parasuis (1,83%) qua phương pháp mutiplex PCR. Khảo sát

vi khuẩn cho thấy 145 mẫu dương tính với P. multocida (66,2%), 31 mẫu dương

tính với A. pleuropneumoniae (14,2%) và 2 mẫu dương tính với H. parasuis

(0.91%). Kết quả cho thấy PCR nhạy cảm hơn.

Ở Hà Lan, Jirawattanapong và ctv (2010) dùng phương pháp nuôi cấy phân

lập để xác định những tác nhân gây bệnh viêm màng phổi trên heo giết thịt tại lò

mổ. Trong tổng số 968 mẫu phổi kiểm tra, có 436 mẫu phổi biểu hiện bệnh tích

viêm màng phổi (45%), 136 mẫu phổi biểu hiện bệnh tích viêm phổi-màng phổi



24



(14%), và 368 mẫu phổi biểu hiện bệnh tích viêm phổi rỉ dịch (38%). Bằng phương

pháp nuôi cấy, 22 mẫu phổi từ 3 loại biểu hiện bệnh tích trên được phân lập với

A.pleuropneumoniae và 55 mẫu được phân lập với P.multocida. Tuy nhiên, kết quả

cho thấy rằng khơng có sự liên quan đặc hiệu giữa tác nhân gây bệnh được phát

hiện với những biểu hiện bệnh tích đại thể, đặc biệt là bệnh tích viêm màng phổi.

Nhóm tác giả nhận định rằng nhiều tác nhân gây bệnh kết hợp với những yếu tố môi

trường để gây bệnh tích viêm màng phổi.

Fablet và ctv (2012) khảo sát sự tương quan giữa bệnh tích đại thể và tỉ lệ

dương tính với M.hyopneumoniae, P.multocida, A.pleuropneumoniae, H. parasuis

và S.suis bằng kỹ thuật PCR trên 3.731 heo giết mổ từ 125 đàn khác nhau ở Pháp.

Bệnh tích viêm phổi chiếm 69,3% và viêm màng phổi là 15%, trong khi đó với kết

quả PCR cho thấy tỉ lệ dương tính với M.hyopneumoniae là 69,3%, P.multocida là

36,9%, A.pleuropneumoniae là 20,7%, H.parasuis là 6,4% và S.suis là 0,99%.

Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy rằng bệnh tích viêm màng phổi có liên quan chặt

với tỉ lệ dương tính A.pleuropneumoniae cao.



25



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×