Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Tài liệu tham khảo từ internet

Tài liệu tham khảo từ internet

Tải bản đầy đủ - 0trang

PHỤ LỤC

1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

1.1 Thiết bị

Máy đo pH

Khuấy từ có điều chỉnh nhiệt độ

Máy tạo dao động

Máy làm ổn nhiệt độ nước

Đồng hồ bấm giờ

Đồng hồ bấm ngược

Máy ly tâm (3000 vòng/phút)

Cân (0.0001g)

1.2 Dụng cụ

Ống nghiệm 12.5ml

Ống nghiệm 25ml

Cốc thủy tinh 25, 50, 150, 250, 500, 600, 2000ml

Pipette 200, 1000, 5000µl

Ơng bóp nhỏ giọt

Muỗng

Đũa khấy thủy tinh

Bình tam giác

Bình định mức 50,100ml

Ống đong 50, 100ml

1.3 Hóa chất

Anhydrous sodium acetate (CH3COONa): 0.1mol/l

Acetic acid (CH3COOH): 0.1 mol/l

3,5-dinitrosalicylic acid (chemical pure)

Glucose (C6H12O6)

Potassium sodium tartrate

Phenol



28



Sodium huydroxide (NaOH)

Mannan (Sigma G0753)

 Nguyên tắc

Mannan được thủy phânoligosaccharide và monosaccharide bởi mannanase,

cả oligosaccharide và lượng đường khử bị tác động bởi DNS trong nước sôi. Trong

phản ứng tạo màu này, mức độ màu tỷ lệ thuận với lượng đường được khử bởi

mannanase, vì vậy có thể xác định được hoạt lực của mannanase. Phân tích cường

độ màu sắc, từ đó hoạt lực của mannanase có thể được tính tốn.

Định nghĩa đơn vị enzyme: một đơn vị mannanase được định nghĩa là lượng

enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường khử từ 3mg/ml dung dịch Mannan

trong một phút với điều kiện pH= 5.5 và 37oC.

 Chuẩn bị hóa chất được sử dụng

i.



Dung dịch glucose: 10mg/ml

Cân chính xác 1g anhyrous glucose, và thêm nước đến 100ml



ii.



Acid acetic (CH3COOH): 0.1mol/l

Pha loãng 0,6 ml dung dịch acetate với 100mlnước.



iii.



Sodium acetate (CH3COONa)

Hòa tan 1.36g sodium acetate trong nước và pha loãng đến 100ml



iv.



Dung dịch sodium hydroxide

Cân 20g sodium hydroxide, thêm nước đến 100ml



v.



Buffer (CH3COOH - CH3COONa)

Thêm 23.14g sodium acetate và 1.7ml acetatevào beaker, hòa tan với nước



để được 2000ml đo pH, chuẩn độ với dung dịch acid acetic hoặc dung dịch sodium

acetate đến pH=5,5.

vi.



Dung dịch Mannan: (0,6%)

Cân chính xác 0,6 g Mannan (sigma G0753), thêm 80ml dung dịch buffer.



dung dịch đã được làm nóng từ từ và khuấy cho đến khi Mannan được hòa tan hồn

tồn, thêm buffer(giữ cho thể tích ít hơn 100ml). Ngừng làm nóng và làm nguội



29



bằng nhiệt độ phòng, khuấy liên tục trong 30 phút, hòa tan với dung dịch buffer

(5.2.5) để được 100ml. Dung dịch này nên được giữ và sử dụng ngay.

vii.



DNS

Cân 3,15g 3,5-dinitrosalicylic acid (chất tinh khiết), thêm 500ml nước, khuấy



trong 5 giây, ủ trong water bath ở 450C, thêm 100ml sodium hydroxide (5.2.4)

khuấy liên tục cho đến khi trở thành dung dịch trong suốt (lưu ý: nhiệt độ trong quá

trình này nên khơng q 480C). Sau đó thêm 91g potassium sodium tetrate, 2,5 g

phenol, 2,5 g anhyrous sodium sunfite. Hỗn hợp này được ủ lại trong water bath ở

450C, thêm 300ml nước vào và khuấy liên tục cho đến khi tất cả chất rắn hòa tan.

Làm nguội bằng nhiệt độ phòng, và pha loãng với nước đến 1000ml. Cho dung dịch

vào chai màu và được lưu trữ trong 7 ngày ở nơi tối, điều kiện nhiệt độ phòng. Sau

7 ngày, dung dịch DNS có thể được sử dụng trong 6 tháng.

 Lập đường chuẩn

i.



Chuẩn bị dung dịch Glucose:

Glucose: sấy ở 1050C trong 2-3h

Cân 1g glucose, cho acetate sodium buffer vào pha lỗng đến 100ml.

Chuẩn bị 7 bình định mức 100ml đã tráng bằng acetate sodium buffer.

Đánh số thứ tự từ 1 đến 7 cho 7 bình định mức.

Sử dụng micro pipet hút dung dịch glucose vào từng bình theo trình tự 1ml,



2ml, 3ml, 4ml, 5ml, 6ml, 7ml để pha các dung dịch glucose ứng với các nồng độ

khác nhau.

Cho thêm buffer vào từng bình cho đến vạch 100ml.

ii.



Lập đường chuẩn

Chuẩn bị các ống nghiệm 25ml, ứng với mỗi nồng độ cần 2 ống nghiệm và 2



ống nghiệm cho dung dịch cotrol.

Lấy 1ml buffer cho vào tất cả các ống nghiệm kể cả 2 ống control.

Hút tiếp 1ml buffer vào ống control.

Hút 1ml dung dịch glucose đã pha ở từng bình vào các ống nghiệm tương

ứng với các nồng độ khác nhau (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần).



30



Cho 2.5ml dung dich DNS vào tất cả các ống nghiệm kể cả control.

Vortex các ống nghiệm.

Đun các ống nghiệm trong 5 phút.

Lấy ra làm nguội trong 5 phút.Thêm nước đến 12.5ml.vortex.

Đo hệ số hấp thụ ở bước sóng 540nm, ghi lại kết quả, lập đường chuẩn.

Đường chuẩn được lập phải có R≥0,99

Chú ý mỗi lần pha dung dịch DNS mới cần lập lại đường chuẩn mới.

 Xác định hoạt lực enzyme tinh chất

i.



Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu rắn: cân 2 mẫu (mannanase) song song (chính xác đến



0.001g), thêm 100ml dung dịch buffer, lắc mạnh và ủ trong 30 phút .Lấy 1ml dung

dịch vừa pha, pha loãng với dung dịch đệm với nồng độ thích hợp để hoạt lực của

enzyme từ 0.04-0.08U/ml.

Chuẩn bị mẫu chất lỏng: lấy 1ml mẫu chất lỏng, pha loãng với dung dịch

đệm để được 100ml. Sau đó tiếp tụcpha lỗng với nồng độ thích hợp.

ii.



Đo hoạt lực enzyme

Đầu tiên, ủ dung dịch mannan trong water bath ở nhiệt độ 370C trong 10



phút.

Ống control: cho 2ml dung dịch mannase vào ống control và cho vào water

bath ủ trong 5 phút ở 370C, thêm 5ml DNS, vortex, đun trên bếp trong 5 phút. Làm

nguội cho thêm nước đến 25ml.

Ống sample: cho 2ml dung dịch mannanase và ống nghiệm và ủ trong water

bath trong 5 phút, cho thêm 2ml dung dịch mannan, vortex, cho vào water bath

trong 30 phút, cho 5ml DNS, vortex đun trên bếp trong 5 phút, làm nguội 5 phút.

Đo hệ số hấp thụ ở bước sóng 540nm, ghi lại kết quả.

iii.



Cơng thức tính hoạt lực



31



XD: hoạt lực của dung dịch sau khi pha loãng (U/ml)

AE: độ hấp thụ của dung dịch mẫu

AB: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn

K: độ dốc của đường cong tiêu chuẩn

Co: đánh chặn của đường cong tiêu chuẩn

M: trọng lượng phân tử glucose (180)

t: thời gian phản ứnng

1000: yếu tố biến đổi, 1mmol = 1000 µm

Giá trị của XD nên nằm trong khoảng từ 0.04-0.08 U/ml

X = XD * Df/m

Trong công thức:

X: hoạt lực của mannanase (U/g)

Df: độ pha loãng

m: trọng lượng mẫu (g)



32



2. Bảng số liệu thống kê

Bảng Anova kết quả hoạt hoạt lực các loại enzyme

Source DF



SS



MS



F



P



Enzyme 5 7392842 1478568 17159.21 0.000

Error 24



2068



86



Total 29 7394910



Bảng Anova kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme A

Source



DF Seq SS Adj SS Adj MS



F



P



Temp.



2 1.05750 1.05750 0.52875 3551.80 0.000



Time



2 0.03254 0.03254 0.01627 109.28 0.000



Temp.*Time 4 0.13404 0.13404 0.03351 225.09 0.000

Error



36 0.00536 0.00536 0.00015



Total



44 1.22944



Bảng Anova kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme B

Source



DF Seq SS Adj SS Adj MS



F



P



Temp.



2 4.4086 4.4086 2.2043 11.42 0.000



Time



2 7.7959 7.7959 3.8979 20.19 0.000



Temp.*Time 4 23.2055 23.2055 5.8014 30.04 0.000

Error



36 6.9512 6.9512 0.1931



Total



44 42.3613



Bảng Anova kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ sấy lên enzyme C

Source



DF Seq SS Adj SS Adj MS



F



P



Temp.



2 202.16 202.16 101.08 8.08 0.001



Time



2



53.63



53.63 26.81 2.14 0.132



Temp.*Time 4 1171.34 1171.34 292.84 23.41 0.000

Error



36 450.34 450.34 12.51



Total



44 1877.47



33



Bảng Anova kết quà ảnh hưởng của pH đến hoạt lực enzyme A

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS

F P

pH

2 0.54974 0.54974 0.27487 26067.07 0.000

Error 12 0.00013 0.00013 0.00001

Total 14 0.54987



Bảng Anova kết quà ảnh hưởng của pH đến hoạt lực enzyme B

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS

pH



F



P



2 292.40 292.40 146.20 1737.66 0.000



Error 12



1.01



1.01



0.08



Total 14 293.41



Bảng Anova kết quà ảnh hưởng của pH đến hoạt lực enzymeC

Source DF Seq SS Adj SS Adj MS

pH



F



P



2 22298 22298 11149 2601.76 0.000



Error 12



51



51



4



Total 14 22349



34



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Tài liệu tham khảo từ internet

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×