Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
KẾT QUẢ CẢM ỨNG TỔNG HP PROTEIN Ở E. COLI

KẾT QUẢ CẢM ỨNG TỔNG HP PROTEIN Ở E. COLI

Tải bản đầy đủ - 0trang

MỘT HỆ

THỐNG TẠO

DÒNG BIỂU

HIỆN Ở E.

COLI



Ví dụ : Chủng BL21 DE 3 đột biến mất proteases Lon,

OmpT

Chủng Rosetta có thể cung cấp tRNAs cho 7 codon



 Tinh sạch protein dựa trên ái lực giữa trình tự mục tiêu và

ligand cố đònh:

- Polyhistidine-tag (hexa histidine-tag – 6XHis-tag) : dựa trên

ái lực giữa một chuỗi His với ion Ni 2+ cố đònh thông qua

chelators (NTA-nitriloacetic acid, IDA-iminodiacetic acid)

- GST-tag : dựa trên ái lực giữa glutathione-S-transferase với

glutathione cố đònh

- FLAG-tag : DYKDDDDK, sử dụng kháng thể antiFLAG M1, 2, 5

để tinh sạch ; làm tăng tính tan của protein và có chứa trình

tự nhận biết của enterokinase

- MBP-tag (Maltose Binding Protein) / maltose : protein của

vùng periplasmic, tăng khả năng thu nhận protein trong E.

coli, sử dụng giá thể chứa maltose để tinh sạch



TINH SẠCH PROTEIN ĐÁNH DẤU

Các bước :

 Tạo dòng gene mục

tiêu vào vector có mang

trình tự dùng tinh sạch (+

trình tự cơ chất của

protease)

 Biến nạp vào E. coli và

cảm ứng tạo fusion

protein

 Thu dòch tế bào  cột,

bead, ..

 Thủy giải bằng

protease đặc hiệu

 Thu nhận protein TTH



TINH SẠCH PROTEIN ĐÁNH DẤU HISTIDINE



THỦY GIẢI FUSION PROTEIN ĐỂ THU

NHẬN PROTEIN MỤC TIÊU



Các protease đặc hiệu sử dụng :

Thrombin

Leu-Val-Pro-ArgGly-Ser



His-tag/GST fusion protein



Factor Xa

Ile-Glu/Asp-Gly-Arg 

Enterokinase

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 



MBP fusion protein



TẠO DÒNG TRONG NẤM MEN

Vì sao dùng vector nấm men ? Phù hợp cho sản xuất lớn

và sử dụng an toàn, tạo dòng trình tự kích thước lớn, cơ

chế hoạt động của eukaryote (điều hòa, spliing, glyosyl

hóa, …)

Phù hợp với các protein chứa liên kết disulfide và được

glycosyl hóa

Các loại vector :

YIp : ổn đònh, YEp : số bản sao lớn, YRp : có thể gắn

chèn vào NST, YCp : thuận tiên cho các nghiên cứu “bổ

sung” , YAC : thu nhận trình tựtạo dòng lớn (> 40 kb), Ty :

nhân bản sau khi gắn chèn vào NST

Chủng chủ thường là Pichia pastoris

Ứng dụng :

- Tổng hợp protein

- Nghiên cứu điều hòa gene



TẠO DÒNG BIỂU HIỆN & CHUYỂN GENE

VÀO TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (TRANSFECTION)

Kỹ thuật chuyển gene vào tế bào động vật, đặc biệt

là tế bào động vật có vú Mục tiêu :

- Nghiên cứu biểu hiện gene ở tế bào động vật, đặc

biệt là những sản phẩm cần được biến đổi sau dòch

mã hoặc các gene có chứa intron

- Sản xuất protein hoặc dùng cho liệu pháp gene

- Tạo động vật chuyển gene

Một số vấn đề thực nghiệm

Vector

Gồm 3 nhóm : (1) Plasmid, (2) Plasmid + trình tự eukaryote,

(3) Vector dùng nhân bản gene và gắn chèn vào bộ

gene tế bào chủ

(1) Plasmid + hệ thống phiên mã của ĐV có vú : nhân

bản trong E. coli  chuyển vào tế bào ĐV có vú, gene

gắn chèn vào bộ gene tế bào chủ và biểu hiện bền

vững nhưng yếu

(2) Plasmid + trình tự khởi đầu sao chép eukaryote +

promoter/enhancer (SV40) : hệ thống biểu hiện tạm thời



CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO ĐỘNG

VẬT



Biện pháp chuyển

1. Biện pháp hóa học : Calcium phosphate, DEAE dextran

(polycation)

2. Biện pháp lý học : Điện biến nạp, vi tiêm, liposome, ..

3. Sử dụng vector virus : SV40, baculovirus, retrovirus,

adenovirus, ..…

Marker chọn lọc

- Thymidine kinase (tk) : tổng hợp thymidine, chọn lọc trên

môi trường HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) với

tế bào chủ tk- Dihydrofolate reductase : kháng methotrexate, tế bào CHO

dhfr- Aminoglycoside phosphotransferase (APH) : kháng các

kháng sinh họ aminoglycoside (kanamycin, neomycin,

geneticin – G418) – Hygromycin B phosphotransferase

- XGPRT–HGPRT (Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase) :

khaùng mycophenolic acid

- .. ..

Các thành phần của một vector TTH :

1. Plasmid pBR322 chứa : replicon prokaryote (E. coli) + gene

kháng kháng sinh + một số trình tự RE



REPORTER GENE

Reporter gene : gene mã hóa cho protein chỉ thò dễ nhận

biết, được nối với gene mục tiêu để phát hiện và xác

đònh biểu hiện của gene mục tiêu

Các hệ thống thông dụng :

Protein

Hoạt tính & đo lường

 CAT (chloramphenicol acetyl

Chuyển nhóm acetyl đánh dấu

phóng xạ lên

transferase)

chloramphenicol ; phát hiện bằng

sắc ký lớp

mỏng/phóng xạ tự ghi

Nay thay bằng ELISA phát hiện

enzyme CAT

 GAL (-galactosidase)

Thủy giải galactoside không màu 

có màu

X-Gal/IPTG

 GUS (-glucuronidase)

Thủy giải glucuronide không màu

 có màu

MUG phát huỳnh quang, X glucuronide có màu

 LUC (luciferase)

Oxy hóa luciferin phát quang



VÍ DỤ VỀ REPORTER GENE :

GFP



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

KẾT QUẢ CẢM ỨNG TỔNG HP PROTEIN Ở E. COLI

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×