Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
1Phương pháp tạo giống ngô biến đổi gen Bt11

1Phương pháp tạo giống ngô biến đổi gen Bt11

Tải bản đầy đủ - 0trang

Phương thức hoạt động của gen pat: gen pat mã hố enzyme phosphinothricin-N-acetyl

transferase có tác dụng khử glufosinate ammonium, thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ

Basta®. Glufosinate ammonium ngăn chặn sự xúc tác tổng hợp glutamine của cây, gây ra q

trình tích luỹ ammonia trong các mơ thực vật, khiến cho cây bị chết. Cây chuyển gen biểu hiện

gen pat sẽ được bảo vệ trước thuốc diệt cỏ có chứa hoạt chất glufosinate ammonium.

b.Đặc điểm giống ngô nền NK66

Giống ngô NK66 là giống ngô lai đơn đã được cho phép thương mại hóa ở Việt Nam từ năm

2006. NK66 là giống quốc gia, thích nghi rộng và có thể trồng trên tất cả các vùng sinh thái và

mùa vụ khác nhau. Giống cho năng suất cao, ổn định và được nông dân và người tiêu dùng ưa

chuộng với diện tích trồng năm 2010 vào khoảng 70000 ha/1.1 triệu ha ngô. Sau đây là một số

đặc điểm nông sinh học và chế độ canh tác cho ngô NK66 ở Việt Nam:

- Thời gian sinh trưởng: 95-100 ngày 19

- Dạng hình cây gọn, bộ lá đứng

- Lá bi bao kín trái bắp

- Bắp to, hạt hình trụ có 14-16 hàng hạt/bắp

- Khả năng thích ứng rộng

- Cho năng suất 12-14 tấn/ha

- Sử dụng để chế biến thức ăn gia súc, gia cầm

c.Q trình chuyển nạp gen

Ngơ Bt11 được tạo ra từ dòng bố mẹ ban đầu được chuyển gen sử dụng plasmid pZO1502

mang gen kháng sâu và chống chịu thuốc diệt cỏ glufosinate ammonium, phương pháp chuyển

gen dung hợp tế bào trần (protoplast transformation) sau đó tái sinh cây.

Vị trí đoạn gen được chuyển: Đoạn gen được chèn vào nằm ở dọc trên nhiễm sắc thể số 8.

Việc chèn đó kết hợp vững chắc vào trong nhiễm sắc thể cây ngô và được di truyền như một gen

trội đơn theo quy luật di truyền Mendel.

Số lượng bản sao của gen đưa vào: Vị trí chèn là 1 bản sao của cả gen Bt và pat và được điều

khiển bởi đoạn vector 35S trên nhiễm sắc thể số 8. Ngoài ra, vị trí chèn cho thấy tính ổn định của

gen được di truyền qua các thế hệ và biểu hiện như một tính trạng trội theo quy luật di truyền của

Mendel.

Plasmid pZO1502 có nguồn gốc plasmid pUC18 được chèn 2 phân đoạn gen 35S1/intron/BtkHD-1/nos và 35S-2/intron/pat/nos. Gen Btk là một phiên bản biến đổi của toàn bộ

chiều dài gen Cry1A(b) của vi khuẩn Bacillus thurigiensis var. kurstaki chủng HD-1. Gen Btk có



nguồn gốc từ phân đoạn Ncol-BglII dài 1,8 kb. Sự thay đổi gen Cry1A(b) bao gồm những thay

đổi trên ADN và được xén bớt để tăng sự biểu hiện trên cây. Gen pat (phosphinothricin acetyl

transferase) được dòng hố từ vi sinh vật có trong đất Steptomyces viridochromogenes chủng

Tu494. Đoạn ban đầu được thay đổi để tối thích sự biểu hiện ở thực vật. Hai gen Btk và pat đều

sử dụng promoter 35S có nguồn gốc từ virus khảm bơng CaMV để khởi động biểu hiện liên tục

cho gen và phân đoạn IVS có nguồn gốc từ ngơ để tăng cường sự biểu hiện của gen trên thực vật.

Ngoài ra plasmid pZO1502 còn chứa các gen chỉ thị bla – kháng kháng sinh ampicillin, gen lacZ

– mã hóa β-galactosidase có chức năng chỉ thị màu ứng dụng trong chọn lọc vi khuẩn của kỹ

thuật gen.



Tế bào dòng ngơ độc quyền H8540 của Syngenta được phân hủy thành tế bào bằng enzyme

pectinase để thu được tế bào trần. Xung điện thời gian 5/1000 giây để biến nạp plasmid qua lỗ

thông tạm thời trên bề mặt màng nguyên sinh tế bào trần. Tại đây, phân đoạn gen Btk và gen pat

tách ra khỏi plasmid và cùng chèn vào cánh dài nhiễm sắc thể số 8 của tế bào với 01 bản sao duy

nhất. Gen amp cũng như bất kỳ đoạn không mong muốn khác của plasmid đều không bị chuyển

vào hệ gen của tế bào cây. Thực hiện chọn lọc các tế bào được biến nạp thành công và tái sinh

chúng thành cây biến nạp hoàn chỉnh. Cây chuyển gen ban đầu này được lai hồigiao/lai chéo với

các dòng khơng chuyển gen có cùng đặc tính của cơng ty và sử dụng như nguồn lai thương mại

bố mẹ. Sự kiện chuyển gen ngô Bt11 được khảo nghiệm ở Việt Nam trên giống nền NK66.

d.Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng của cây trồng biến đổi gen đối với môi trường và đa dạng

sinh học

 Đánh giá nguy cơ trôi gen, phát tán gen của ngô Bt11 sang cây trồng khơng chuyển



gen và các lồi họ hàng của nó thơng qua hạt phấn.



Nguy cơ trơi gen đến các lồi hoang dã tương thích về mặt sinh sản ở Việt Nam được đánh giá

là khơng có khả năng xảy ra do các loài hoang dại cùng chi Zea không tồn tại ở Việt Nam. Xét

đến yếu tố lai xa giữa các chi cùng tông Maydeae, Việt Nam khơng có cũng như khơng trồng các

lồi họ hàng với ngơ ví dụ như cây cao lương, vì vậy khả năng sự kiện chuyển gen Bt11 phát tán

sang trong điều kiện canh tác hay trong tự nhiên cũng hoàn toàn khơng có. Xét về mặt cấu tạo,

thời gian phát tán phấn của ngô diễn ra ngắn và khoảng cách không gian tương đối hẹp cũng làm

giảm nguy cơ phát tán gen. Về mặt truyền thống canh tác, ngô trồng ở Việt Nam được thu hoạch

triệt để, khơng còn sót lại sau mỗi mùa vụ. 95% diện tích trồng ngơ Việt Nam hiện nay là ngơ lai,

do đó đa số nơng dân khơng còn tập qn tái sử dụng hạt thương phẩm làm ngô giống cho vụ

sau. Tất cả những lý do trên đã minh chứng cho khả năng trôi gen, phát tán gen của ngô Bt11

sang các cây trồng không chuyển gen và các lồi họ hàng là khơng có. Như vậy sự kiện chuyển

gen này hồn tồn khơng làm phát sinh một giống ngô mới trong điều kiện canh tác ở Việt Nam.





Đánh giá nguy cơ trôi gen ngang sang các lồi vi sinh vật:



Phân tích nguy cơ truyền gen từ ngô Bt11 đến các vi sinh vật, các bằng chứng khoa học cho

thấy: rất khó có khả năng ADN tái tổ hợp được truyền từ ngô Bt11 tới các loài vi sinh vật trong

đất hoặc trong bộ máy tiêu hoá của người và động vật. Biểu hiện của gen Cry1Ab và gen pat

trong ngô Bt11 được điều khiển bởi promoter eukaryote và promoter này hầu như không hoạt

động trong mơi trường tế bào prokaryote. Bên cạnh đó, tính trạng biểu hiện của các gen này cũng

không phải là ưu thế chọn lọc của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên, nên việc xảy ra trao đổi

chéo cũng hiếm khi xảy ra. Với người và động vật, ADN còn bị phân hủy nhanh trong bộ máy dạ

dày/ruột nên q trình truyền gen ngun vẹn càng khơng thể diễn ra.





Đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại dịch hại xâm lấn môi trường tự nhiên.



Trong các cây trồng biến đổi gen thương mại hiện nay, nguy cơ phát triển thành cỏ dại được

đặc biệt quan tâm. Các nhà khoa học lo lắng rằng các gen chuyển chống chịu với thuốc trừ cỏ sẽ

khơng làm tăng đặc tính cỏ dại của các lồi hoang dại liên quan, bởi vì những gen này có thể gây

hại hoặc trung tính với các loại hoang dại họ hàng. Tuy nhiên, trong các trường hợp mà các thuốc

trừ cỏ được sử dụng để kiểm sốt cỏ dại, tính kháng cỏ dại có thể mang lại những lợi nhuận cạnh

tranh cho các cây trồng tự nhiên không mong muốn.

Nếu cây trồng biến đổi gen được trồng ở những nơi có lồi họ hàng hoang dại sinh trưởng,

hiện tượng lai tự nhiên có thể xảy ra. Với ngô Bt11, gen diệt sâu đục thân Btk và chống chịu

thuốc trừ cỏ pat được chuyển lo ngại có thể tồn tại và xâm nhập vào các quần thể tự nhiên, nó có

thể làm tăng sự đa dạng di truyền hoặc xâm lấn dẫn đến sự tuyệt chủng của các quần thể hoang

dại. Nguy cơ này được nghiên cứu, xem xét qua 3 vụ khảo nghiệm hạn chế và một vụ khảo

nghiện diện rộng tại các 4 vùng trọng điểm ngô ở các tỉnh thành khác nhau ở Việt Nam. Đặc tính

ngủ nghỉ của hạt, đặc điểm nơng sinh học, sinh trưởng, phát triển và các đặc điểm kiểu hình là

những chỉ số nhằm so sánh và đánh giá nguy cơ trở thành cỏ dại như phương pháp tiếp cận

nghiện cứu và đánh giá của các nước đã phê chuẩn và OECD. Tất cả các khảo nghiệm đều cho



kết quả thấy ngơ Bt11 có đặc điểm nơng sinh học (thời gian mọc mầm của hạt, các mốc sinh

trưởng, tổng thời gian sinh trưởng, tỷ lệ gẫy thân, đổ rễ …) và hình thái (chiều cao cây, chiều cao

đóng bắp, hình dạng và màu sắc hạt…) là hồn tồn tương tự với giống cùng dòng khơng chuyển

gen NK66. Bên cạnh đó, các đánh giá về mức độ nhiễm một số bệnh hại ngơ chính như bệnh khơ

vằn, gỉ sắt, đốm lá lớn, đốm lá nhỏ cũng cho thấy tính mẫn cảm với các loại bệnh này là tương

đương giữa ngô Bt11 và giống ngô thường NK66. Những kết quả này chứng minh rằng: ngô

Bt11, tương tự như giống nền NK66, khơng mang các đặc tính của cỏ do vậy khơng có nguy cơ

trở thành cỏ dại xâm lấn mơi trường tự nhiên

Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng của ngô biến đổi gen Bt11 đối với các sinh vật

khơng chủ đích trong hệ sinh thái





-



Sinh vật khơng chủ đích thuộc bộ cánh vảy Lepidopteran:



Bộ cánh vẩy được chia làm 2 nhóm: bướm và ngài. Trong nhóm ngài, các lồi sâu đục thân là

những cơn trùng chính ăn trực tiếp cây. Tuy nhiên ngoài Ostrinia furnacalisi, các loài sâu đục

thân khác hiếm gặp trên ngô hơn trong khi bướm và đa số các lồi bướm đêm khơng kiếm ăn

trực tiếp trên cây ngô và con đường duy nhất để tiếp xúc với protein Cry1Ab có thể do ăn ấu

trùng trên cây có bám hạt phấn. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện gen thành protein Cry1Ab trong

phấn ngô Bt11 rất thấp (< 90 ng/g phấn). Do đó, ảnh hưởng của ngơ Bt11 đến cơn trùng khơng

chủ đích thuộc bộ cánh vảy là khơng đáng kể.

-Các lồi cơn trùng khơng chủ đích khơng thuộc bộ cánh vảy.

Theo như xác định đối tượng nghiên cứu đã nêu trên, với sinh vật khơng chủ đích thuộc 2

nhóm đối tượng chính: nhóm động vật chân khớp trên ruộng ngô (sâu hại, thiên địch bắt mồi ăn

thịt, thụ phấn,...) và nhóm cơn trùng trong đất (collembola). Đó là những nhóm sinh vật khơng

chủ đích đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn, có thể trực tiếp hay gián tiếp chịu ảnh

hưởng của ngơ Bt11. Ngồi các thành phần và mức độ nhiễm bệnh hại chính trên ngơ cũng được

theo dõi và đánh giá.

+ Nhóm động vật chân khớp trên khơng bao gồm các lồi chân khớp, rệp muội hại ngơ, một

số lồi thiên địch quan trọng với nhiều loại sâu hại ngơ trong đó có sâu đục thân như nhóm bọ

rùa bắt mồi ăn thịt, nhóm nhện lớn bắt mồi ăn thịt, nhóm bọ xít mù xanh, cánh cứng cánh ngắn:

Kết quả khảo nghiệm tại Việt Nam cũng như thế giới cho thấy thành phần và mật độ các lồi cơn

trùng khơng chủ đích diễn biến tương tự như nhau trên ngô Bt11 và ngô không biến đổi gen.

+ Nhóm sinh vật đất: Quần xã Collembola được coi là phản ánh đặc điểm của môi trường sinh

sống. Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như thực tế ngồi đồng ruộng chỉ ra rằng ngơ

Bt11 khơng ảnh hưởng đến Collembola. Cụ thể là, bên cạnh khả năng phân hủy nhanh trong đất

của protein Cry1Ab, protein này cũng gây độc đối với Collembola cũng như các loài giun đất và

giun tròn. Các khảo nghiệm đồng ruộng khơng thấy có sự sai khác có ý nghĩa về thành phần loài,

phân bố, số lượng loài và mức độ phong phú của Collembola giữa ngô đối chứng NK66 và ngô



Bt11. Với nhóm vi sinh vật đất có liên quan đến các chu trình các-bon và ni-tơ, các nghiên cứu

ghi nhận độc tố Bt có rất ít ảnh hưởng tới thành phần vi sinh vật trong đất.

-



Ảnh hưởng của ngô Bt11 đến các bệnh hại ngô



Các kết quả điều tra về thành phần bệnh hại và mức độ hại của một số loại bệnh chính trên

ngơ như khơ vằn (Rhizoctonia solani), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm lá, khảm virut và một số

bệnh khác được tổng hợp lại từ các khảo nghiệm với mục đích đánh giá có hay khơng ảnh hưởng

của ngơ Bt11 đến nhóm vi sinh vật gây bệnh hại dựa trên so sánh với các kết quả điều tra trên

giống nền NK66. Nhóm nghiên cứu đã ghi nhận hầu hết các bệnh hại chính trên ngơ đều xuất

hiện trên cả ngô Bt11 và ngô không chuyển gen. Một số bệnh chưa được ghi nhận trên ngô Bt11

do tần suất bắt gặp ít và tỷ lệ bệnh thấp.

Kết luận: Ngơ biến đổi gen mang sự kiện Bt11 có các đặc tính nông sinh học của giống ngô

truyền thống, không mang nguy cơ trở thành cỏ dại xâm lấn, không tác động đến quần thể sinh

vật khơng chủ đích. Ngơ Bt11 hồn tồn khơng gây ảnh hưởng bất lợi đến mơi trường tự nhiên

và đa dạng sinh học.

e.Thông tin về rủi ro của sinh vật biến đổi gen đến sức khỏe con người

Thông tin các rủi ro của sinh vật biến đổi gen gây ra đối với sức khoẻ con người đã được ghi

nhận.

Độ độc tính của protein Cry1Ab và protein PAT được đánh giá thí nghiệm trên động vật thay

thế cho nghiên cứu ở người. Các nghiên cứu đều cho thấy cả hai protein này đều khơng gây độc

cấp tính cho cơ thể động vật, ngoài ra chúng dễ dàng bị thủy phân trong môi trường giống như

ruột của người và mất hoạt tính ở nhiệt độ cao. Đánh giá nguồn tác nhân gây dị ứng khơng thấy

có nguy cơ do trình tự protein khơng tương đồng với bất kỳ tác nhân dị ứng nào đã biết và cả hai

loại protein này đều dễ dàng bị thủy phân bởi enzim pepsin. Cùng với sự có mặt với nồng độ

thấp của hai protein trên ngô, mức phơi nhiễm của người và động vật đối với chúng là thấp.

Tổng hợp tất cả các yếu tố trên cùng với lịch sử sử dụng an tồn trên tồn thế giới, đưa ra kết

luận Ngơ Bt11 an toàn để sử dụng làm thực phẩm cho người giống như ngô không chuyển gen.

2.2.Kỹ thuật chuyển gen: Phương pháp bắn gen

• Súng bắn gen là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế





đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.

Hạt vàng hay won-fram, đường kính 1-4 µm bọc ADN, được kết tủa với CaCl2,

spermidine hoặc PEG. Hạt bọc ADN được tăng tốc (300-600 m/s) bằng một thiết bị ñặc

biệt gọi là máy bắn hạt. Với tốc độ này hạt xâm nhập qua thành và màng tế bào. Mật độ







hạt sử dụng phải được điều chỉnh sao cho không làm tổn thương tế bào.

Phương pháp này cũng được sử dụng để chuyển gen vào lạp thể và ti thể.







Các mơ được biến nạp: mơ phân sinh ngọn, mô tế bào, mô sẹo phôi, lá bao mầm, phôi

trưởng thành và không trưởng thành, phiến lá, phấn hoa, vi bào tử và cánh hoa, rễ và







phần thân.

Quy trình:



Hình đầu là vi khuẩn đã mang gene mục tiêu (gen đích cần chuyển) gen này đã được trải qua

quá trình tách dòng và gắn vào plasmid. Khi đã kiểm tra chính xác là gene đó rồi, sau đó tăng

sinh khuẩn đó lên với số lượng lớn. Tách lấy gene mục tiêu rồi thu lại gene đó, mang gene đó

trộn với hạt vàng hoặc tungsteng. Đồng thời với việc nuôi và tách gene từ khuẩn cũng phải nuôi

cấy mô phôi ngô, thường chọn phôi 7-10 ngày tuổi là tốt nhất, phù hợp với chuyển gene. Nuôi

mô sẹo hoạc nuôi cấy tạo cây chính thức (giai đoạn được 4 - 5 ngày mang đi biến nạp là tốt

nhất).

Với mẫu và gen đã được chuẩn bị ở trên tiến hành bắn gene trực tiếp. Khi bắn gene này sẽ sảy

ra trường hợp đó là khi hạt vàng hoặc tungsteng với lực áp xuất bắn mạnh sẽ làm tế bào dập nát

khá nhiều, các hạt đó có mang gene, các gene này được giữ lại ở vị trí nào đó trong tế bào như

nhân, TBC nhưng mục tiêu của chúng ta là gen đó ở nhân. Hạt vàng đi đâu khơng quan tâm, nó

có thể ở trong tế bào nhưng khơng ảnh hưởng tới quá trình phát triển của tế bào. Rất nhiều tế bào

bị chết sau khi bắn gene đó ( do hạt vàng làm tế bào nát, không phục hồi được). Những gene

được vào đúng vị trí nhân có thể sẽ gây nên quá trình insert vào genenome của tế bào thành

cơng,



nhưng



cũng







gene



vào



đến



nhân



nhưng



khơng



insert



được.



Sau đó ni phục hồi tế bào sau chuyển gene tầm 5 ngày, sau thời gian nuôi phục hồi, tiến hành

chọn lọc cây đã được chuyển gen ( đoạn gene mình chuyển có gene chọn lọc thực vật là

hygromycin, ppt, đường manost). Cây nào sống là đạt ( nhưng có thể khơng mang gene 100%)



cũng có nhiều tế bào gene được chuyển lại nằm ở hệ gene ty thể, lạp thể ( ở tế bào chất) nó vẫn

khơng chết khi sàng lọc. Tiếp theo nuôi cây, ra cây, tiến hành kiểm tra PCR với mồi đặc hiệu với

gene mục tiêu. Nếu PCR lên ta kiểm tra trực tiếp, nếu chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ thử

nghiệm bằng cách phun thuốc diệt cỏ 3 lần (cách nhau xa), chuyển gene kháng sâu thử nghiệm

bằng thả sâu và xem tỷ lệ sâu chết ( sâu phải đúng là loại sâu mà bị chết do protein gene đích tạo

ra). Nếu sâu chết hoặc cỏ chết mà cây không sao tiến hành lai phân tử tiếp sau đó, các bước như

saotherblot ( kiểm tra sự có mặt của gene đích trong hệ gene), notherblot ( kiểm tra sự phiên mã

của gene mục tiêu) có từ DNA sang RNA không, kiểm tra westblot (kiểm tra xem có tạo ra

protein khơng) kiểm tra dịch mã của RNA sang Protein. Nếu đạt hết -> để cây ra hoa kết trái thu

quả -> lấy hạt đó trồng đúng mùa vụ. Khi lên cây con tiếp tục kiểm tra T1 từ bước tách DNA đến

PCR và cuối cùng là WESTBLOT, kiểm tra tới đời T3 mà vẫn tốt thì sẽ có một giống mới (Sở dĩ

phải kiểm tra tới T3 để xem sự di truyền gene mục tiêu sang đời sau có được tiến hành khơng).

 Ưu điểm:

• Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào. Q trình chuyển gen nhanh, đơn giản về







mặt kỹ thuật.

Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.

Các vector mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn giản. khơng đòi hỏi cấu trúc gen kiểu T-









AND như trường hợp chuyển gen bằng Agrobacterium.

Chỉ cần một lượng nhỏ plasmid ADN.

Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vòng vài ngày sau biến

nạp.



 Nhược điểm:

• Nhiều bản sao của gen biến nạp có thể được chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó khăn







cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững.

Hiệu quả chuyển gen thấp.

Đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí vật tư đăt.



Ví dụ: Ngơ event TC1507 kháng côn trùng bộ cánh vảy

a. Sinh vật cho:

- Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. Aizawai dòng PS811 mang gen cry1F kháng côn

-



trùng bộ Cánh vảy.

Vi khuẩn Streptomyces viridochromogenes mang gen chỉ thị pat kháng thuốc trừ cỏ

nhóm glufosinate-ammonium.



b. Sinh vật nhận: Ngô, bắp, bẹ (Maize/Corn)



c. Vật liệu bố mẹ: Các dòng ngơ lai được nghiên cứu và SX bởi C.ty Pioneer Hi-Bred

d. Giống nền: Ngô lai 30Y87

e. Phương pháp chuyển nạp gen tạo dòng ngơ Event TC1507:



Ngơ chuyển gen event 1507 tổng hợp protein Cry1F và phosphinothricin acetyltransferase

(PAT) được tạo ra bằng phương pháp chuyển đoạn DNA thẳng có mang gen cry1F (có nguồn gốc

từ Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. aizawai), gen pat (có nguồn gốc từ Streptomyces

viridochromogenes) cùng các thành phần điều khiển gen cần thiết khác vào các tế bào phôi

(embryos) ngô tự nhiên Hi-II.

Ngô event TC1507 được tạo ra bằng phương pháp bắn gene (Biolistics™ PDS- 1000He) vào

các tế bào phôi ngô Hi-II. Một đoạn DNA thẳng (6235 bp) kí hiệu PHI8999A (Hình 2-1) mang

các gen cry1F, pat và kanr cùng các thành phần điều khiển gen cần thiết khác được cắt ra từ

vector PHI8999 (Hình 2-2) bằng việc sử dụng enzyme PmeI. Các gen này chứa thông tin tổng

hợp delta -endotoxin của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. aizawai PS811; phosphinothricin

acetyltrasnferase từ nấm Streptomyces viridochromogenes và kháng kháng sinh kanamycin.

Protein Cry1F trong ngô chuyển gen TC1507 là protein nhân tạo, có cấu trúc ngắn hơn so với

protein trong vi khuẩn Bt tự nhiên. Protein này có hả năng diệt sâu đục thân châu Âu (Ostrinia

nubilalis), sâu đục thân châu Á (Ostrinia furnacalis), sâu xám (Spodoptera litura) và giảm đáng

kể sự gây hại của các loài sâu này với sự hoạt động của gen cry1F trong ngô BĐG. Sự hoạt động

của gen cry1F trong ngô chuyển gen TC1507 được điểu khiển bởi promoter polyubiqutine có tên

là ubiZM1và có nguồn gốc từ chính cây ngơ (Hình 2-1). Ngơ TC1507 được chứng minh là chỉ

mang duy nhất một đoạn mã (copy number) gen cry1F, được di truyền và luôn thể hiện ổn định

qua các thế hệ.

Ở ngô event TC1507, gen pat, có nguồn gốc từ S. viridochromogenes, mã hóa tổng hợp

phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) và được điểu khiển bởi CaMV 35S promoter. Việc

chuyển gen pat ở thực vật giúp cây có thể tổng hợp protein PAT và do đó có khả năng kháng

thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate -ammonium (Glufosinate). Trong sự kiện TC1507, pat được sử

dụng như là gene chỉ thị, giúp trong q trình chọn lọc để chọn được chính xác các cây ngơ con

có mang gene chuyển nạp. Protein PAT được biểu hiện ở lá với nồng độ thấp 40.8 pg/µg tổng

lượng protein giúp cây ngô con chuyển gene chịu thuốc diệt cỏ chứa glufosinate.

Sau khi chuyển nạp, các tế bào phơi được chuyển vào mơi trường ni cấy có chứa thuốc

diệt cỏ nhóm glufosinate-ammonium như chất chọn lọc, cho phép các tế bào phơi mang gen



chuyển có thể sống sót và tăng trưởng trong môi trường này. Phần lớn các tế bào của cây cũ

(không mang gen chuyển) đã được loại bỏ trong q trình ni cấy trong mơi trường chọn lọc

này. Các tế bào phơi sống sót và tạo các mơ sẹo khỏe, chịu glufosinate-ammonium, sau đó được

tái tạo thành các cây trong nhà kính. Các bước tiếp theo như kiểm tra chuyên sâu hơn bằng phân

tích phân tử (PCR, Northern blot, Sounthern blot vv..), các bước chọn lọc ngoài điều kiện đồng

ruộng cũng như việc kiểm tra, đánh giá khả năng kháng cơn trùng chủ đích ví dụ sâu đục ngô

Châu Âu (Ostrinia nubulalis). Ngô event TC1507 cuối cùng được lựa chọn tạo ra mang tính

kháng một số lồi cơn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera).

3.Ni cấy mơ

a.Xác định thành phần và môi trường nuôi cấy:

- Các nguyên tố đa lượng.

- Các nguyên tố vi lượng.

- Các vitamin

- Các chất tự nhiên.

- Các chất điều tiết sinh trưởng.

- Chất làm đông cứng môi trường – agar.

- Độ ph của mơi trường.

 Vì ngơ là cây thuộc họ hòa thảo nên mơi trường thích hợp cho ni mơ ở ngơ là môi

trường cơ bản (MS) và môi trường chu (N6).

a. Vật liệu: dùng phơi non và nỗn chưa thụ tinh.

b. Các bước tiến hành:

- Noãn: Chọn những noãn to đều khi râu phun được 5 – 7 cm, bóc vỏ ngồi của nỗn, cắt

đoạn khoảng 2 – 2,5 cm rửa sạch bằng cồn ethanol 70 0C. Sau đó đưa vào buồng vô trùng,

-



dùng H2O2 10% để diệt trùng trong khoảng thời gian vài phút.

Phơi: Chọn những phơi non của nỗn đã thụ tinh được 3 – 4 ngày cắt đoạn có kích thước

2 – 3 mm, phơi non của nỗn đã thụ tinh 14 – 24 ngày cắt đoạn 0,5 – 2 mm. Cũng làm

sạch thao tác như trên. Nhằm tạo giống sạch bệnh.



+ Môi trường nuôi cấy: môi trường được sử dụng là mơi trường khống MS và mơi trường

N6.

+ Môi trường tái sinh: sau khi nuôi cấy các calus hình thành đem chuyển sang mơi trường tái

sinh.

+ Mơi trường ra rễ: sau khi cây được tái sinh đưa ra mơi trường rễ. Đó là mơi trường MS bổ

sung thêm 1mg/1NAA.

c. Nhiệt độ nuôi cấy: Nhiệt độ 26oC trong tối với thời gian 2 – 4 tuần.

d. Ánh sáng 2000 – 3000 lux với thời gian chiếu sáng 14/24.



e. Độ ẩm bình thường.

 Trước khi chuyển cây ra vườn ươm, chuyển bình ra nhiệt độ bình thường bên ngồi, để ở



mái hiên nơi có mái che hoăc phủ cót. Tránh ánh nắng trực tiếp mục đích để cây quen dần

với nhiệt độ ngoài trời trong thời gian 1 – 2 tuần tùy thuộc vào độ cứng của cây.



Chọn vật liệu ni cấy



Khử trùng



Tạo trồi



Tạo rễ



Ni cấy vào mơi trường

thích ứng



Trồng cây trong vườn

ươm



IV.Tổng kết

Sản xuất ngô của Việt Nam tăng dần qua các năm do tăng năng suất và tăng diện tích trồng

nhưng vẫn khơng đủ cung ứng cho ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi trong nước (ngành tiêu thụ

chủ yếu sản lượng ngô). Nhập khẩu bắp niên vụ 2012/13 đạt 1,6 triệu tấn, do nhu cầu phát triển

chăn nuôi nên nhập khẩu bắp niên vụ 2013/14 lên đến 1,8 triệu tấn. Và nhiều vấn đề đặt ra cho

nền sản xuất ngơ thế giới nói chung và VN nói riêng: khí hậu tồn cầu đang biến đổi phức tạp,

đặc biệt là lũ lụt, hạn hán ngày càng nặng nề hơn, nhiều sâu bệnh hại mới xuất hiện, sản xuất ngơ

nhiều nơi đang gây nên tình trạng xói mòn, rửa trôi đất; giá nhân công cao, cạnh tranh gay gắt

giữa ngô và cây trồng khác.



Với công tác tạo giống, bộ giống ngô thực sự chịu các điều kiện bất lợi: kháng đất chua, phèn,

kháng sâu bệnh, thời gia sinh trưởng ngắn, năng suất cao, ổn định, chưa nhiều. Vì thế chọn tạo

giống là một trong các giải pháp cần thiết cho giải quyết các vấn đề trên. Kết hợp phương pháp

truyền thống với công nghệ sinh học trong chọn giống, kể cả chuyển gen phổ biến như chịu

thuốc trừ cỏ, kháng sâu đục thân, một số bệnh virus và chịu được các yếu tố phi sinh học như

hạn, chua, phèn, mặn… Thu thập nguồn nguyên liệu theo định hướng con lai cho năng suất cao

ổn định, chống đổ, chịu hạn, ít sâu bệnh, ngắn ngày, thích ứng rộng…để khơng chỉ đáp ứng nhu

cầu trong nước nà còn vươn ra các nước khác. Mở rộng mạng lưới thử nghiệm giống (dòng) ở

nhiều điều kiện sinh thái, nhằm xác định đúng và phát triển nhanh các giống mới phù hợp.



Tài liệu tham khảo

http://www.maizegdb.org/

http://vaas.vn/kienthuc/cayngo/sanxuatngotrenthegioivavietnam.php

www.cuctrongtrot.gov.vn/ctt/images/2011102116649.doc

http://vaas.vn/kienthuc/cayngo/sanxuathatgiongngothuphantudotheophuongphaptruyenthong.php

http://www.bannhanong.vietnetnam.net/home.php?cat_id=27&id=1883&kh=

Viện nghiên cứu ngô



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

1Phương pháp tạo giống ngô biến đổi gen Bt11

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×