Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Phuong phap chiet tach, tinh che emodin, hesperidin va geniposid tu cac duoc lieu nghien cuu de lam chuan

Phuong phap chiet tach, tinh che emodin, hesperidin va geniposid tu cac duoc lieu nghien cuu de lam chuan

Tải bản đầy đủ - 0trang

Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



Kết quả cho thấy ở phân đoạn n-hexan - EA (90:10), sắc ký đồ cho 1 vết có màu

và Rf trùng với vết emodin chuẩn.

− Hứng lấy phân đoạn n-Hexan - EA (90:10), cô chân không, thu cắn emodin

thô

− Tinh chế: Hòa cắn emodin thơ trong aceton, thêm đồng lượng nước, để lạnh

48 giờ.

− Lọc lấy tủa emodin.

− Hòa tủa trong EtOH, thêm đồng lượng nước, để lạnh 48 giờ được tủa emodin

− Lọc lấy tủa emodin

− Sấy khô ở 50 - 60°C thu được emodin tinh khiết.

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế emodin được tóm tắt trong sơ đồ ở

phụ lục 5.

4.4.1.2. Xác định cấu trúc emodin chiết được

Kết quả xác định cấu trúc emodin được thể hiện trong phụ lục 7.2

Emodin tinh khiết sau khi làm khô được xác định cấu trúc bằng phương

pháp phổ khối và cộng hưởng từ hạt nhân tại viện Hóa học cho kết quả như sau:

a. Kết quả của phương pháp MS

Phổ MS của chất khảo sát được ghi trên thiết bị 5989B-HP-MS bằng

phương pháp đưa mẫu trực tiếp (DIP). Trên phổ thấy rõ pic phân tử đồng thời là

pic cơ bản có giá trị M+ (m/z) = 270 amu ứng đúng với công thức phân tử của

Emodin là C15H10O5.

Tra thư viện phổ Wiley 275.1 thấy được phổ của mẫu đo trùng với phổ

emodin trong thư viện tới 93% và cấu trúc được ghi nhân theo danh pháp chuẩn

là: 9,8-Anthracenedione-1,3,8-trihydroxy-6-methyl.

b. Kết quả của phương pháp NMR

- Phổ 13C-NMR; DEPT-90; DEPT-135

Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều (1D-13C-NMR) cho

thấy phân tử mẫu khảo sát gồm 15 cacbon trong đó có 1 nhóm –CH3, 4 nhóm –

CH- và 10 –C-. Đây là một cấu trúc đơn giản nên các pic đều mang tính đặc

trưng. 2 pic ở 189,690 và 181,368ppm rất đặc trưng cho 2 nhóm –C=O. 4 pic –

CH- đều có độ dịch chuyển hóa học (107,910; 108,747; 120,453 và 124,109)

đặc trưng cho –CH= nhân thơm. Pic –CH3 có δ=21,490ppm rất dễ nhận ra là –

CH3 gắn vào nhân thơm, 3 nhóm –C- có độ dịch chuyển 161,393; 164,425 và

165,543 là các cacbon bậc 4 của nhân thơm liên kết với –OH.

Tóm lại phổ 1D-13C-NMR là hồn tồn phù hợp với cấu trúc của Emodin.

- Phổ 1H-NMR và HSQC:



________________________________________________________________________ 359



BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



Mẫu có phổ 1H-NMR bao gồm 5 pic, 4 pic của –CH= nhân thơm đều là

vach rộng hoặc tách vạch với giá trị J rất nhỏ (≈ 2Hz) chứng tỏ các nhóm –CH=

đều cách nhau 1 cacbon bậc 4.

Phổ HSQC cho phép nhân dạng 2 pic –OH ở 10,072 và 12,000 ppm, đây

là 2 – OH có khả năng lập cầu hydro với oxy của ceton.

Nhóm OH còn lại bị trải rộng chi nhân ra được qua gờ nổi trên đường nền

ở khoảng 11,4ppm. Nhóm –CH3 là một vạch đơn ở δ=2.406ppm.

- Phổ HMBC:

Phổ HMBC có vai trò đặc biệt quan trọng cho phép phân biệt 1-OH

(δ=12,072ppm) và 8-OH (δ=12,000ppm). Cũng nhờ phổ HMBC sự phân định vị

trí –C=O (9) và –C=O (10) trở nên rõ ràng vì –C=O (10) có tương quan với –

CH= (5) và –CH= (4). Qua phổ HMBC vị trí thế của 3 nhóm –OH và nhóm –

CH3 được kiểm tra.

Qua bộ phổ NMR, mẫu nghiên cứu đã được khẳng định là Emodin và

bảng số liệu chi tiết đã được xây dựng

Bộ phổ mô phỏng ACD-NMR được xây dựng với mục đích kiểm tra đã

cho kết quả hồn tồn phù hợp.

Từ kết quả phân tích của các phổ trên, chất chiết được khẳng định là

emodin với công thức cụ thể là:

OH



O



H 3C



OH



OH

O



Công thức cấu tạo của emodin

Tên khoa học: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinon

Bộ phổ mơ phỏng ACD-NMR được xây dựng với mục đích kiểm tra đã cho kết

quả hoàn toàn phù hợp.

4.4.1.3. Định tính, thử tinh khiết chất phân lập được bằng các phương pháp

khác

a. Đo nhiệt độ nóng chảy:

Chất phân lập được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, để trong

bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng

chảy. Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 256 - 257°C, phù hợp với nhiệt độ

nóng chảy của emodin theo lý thuyết là 256 - 257°C [72]

b. Đo phổ hồng ngoại

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ

hồng ngoại của emodin chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III. Kết quả

________________________________________________________________________ 360



Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của emodin chuẩn

(phụ lục 7.2).

c.Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với

điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.1.1, đối chiếu với emodin chuẩn

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 2 hệ dung môi, mẫu thử đều cho 1 vết có

cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu emodin.

d. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ

lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với emodin chuẩn Trung Quốc.

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương ứng

với pic emodin trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn emodin và tại thời gian lưu

của pic emodin, phổ UV thu được của thử và của chuẩn trùng khớp nhau.

4.4.1.4. Định lượng emodin chiết được bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng emodin phân lập được bằng phương pháp HPLC

với điều kiện ghi trong dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục 9).

Kết quả: Hàm lượng của emodin chiết được tính theo nguyên trạng là

95,0%.

Nhận xét: Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chất phân lập được là

emodin với hàm lượng khá cao 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu của

một chất chuẩn đối chiếu dùng trong phân tích dược liệu. Phương pháp chiết khá

đơn giản, sử dụng các dung mơi rẻ tiền, ít độc, dễ kiếm. Hiệu suất chiết thu được

khá tốt (khoảng 0,5%), có thể ứng dụng trong quy mơ lớn hơn. Chất emodin đã

phân lập được có thể dùng làm chuẩn để kiểm tra chất lượng đại hoàng và một

số dược liệu khác chứa emodin.

4.4.2.Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì

4.4.2.1.Chiết tách và tinh chế

Qua tham khảo một số tài liệu [7,50] về chiết, tinh chế hợp chất flavonoid,

hesperidin và bằng nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã chọn được quy trình

chiết hesperidin từ Trần bì gồm các bước sau:

− Loại tạp (tinh dầu và chất béo): Dược liệu được phơi khô, tán nhỏ, ngâm

lạnh với ether dầu trong khoảng 4 giờ sau đó cho vào bộ dụng cụ chiết

Soxhlet, chiết nóng trong 16 giờ. Loại bỏ dịch chiết ether dầu. Làm khô



− Chiết xuất: Thêm EtOH 70% vào dược liệu đã được loại tạp, đun sôi hồi

lưu trong cách thủy, lọc lấy dịch chiết

________________________________________________________________________ 361



BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



− Cô dịch chiết EtOH trên cách thủy để bốc hơi bớt cồn, để nguội, cho vào

tủ lạnh để ở nhiệt độ khoảng 5°C cho kết tinh

− Lọc qua phễu lọc xốp lấy tủa

− Hòa tủa trong MeOH nóng, lọc

− Cô dịch MeOH trên cách thủy đến gần cạn, thêm 2 thể tích ước, để ở 50C

cho kết tinh, lọc lấy cắn

− Tinh chế: Thêm EtOH 30% vào cắn, đun trên cách thủy cho tan, để nguội,

cho vào tủ lạnh ở khoảng 5°C cho kết tinh

− Lọc qua phễu xốp lấy tinh thể

− Hòa tủa thu được trong formamid nóng, acid hóa bằng acid acetic, thêm

nước để trong tủ lạnh cho kết tinh lại

− Lọc qua phễu lọc xốp được tinh thể hesperidin tinh khiết

− Sấy khô hesperidin ở 60°C trong 24 giờ

Trong quá trình phân lập và tinh chế, kiểm tra cắn thu được bằng TLC

theo DĐVN III, phụ lục 4.4, điều kiện sắc ký như sau:

+ Dung dịch chuẩn: Hòa tan hesperidin chuẩn trong methanol để được dung

dịch có nồng độ khoảng 0,4mg/ml

+Dung dịch thử: Hòa tan cắn trong methanol để được dung dịch có nồng độ

khoảng 0,4 mg/ml.

+ Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck

+ Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13)

Hệ 2: n-butanol – acid acetic – nước (4:1:5)

Hệ 3: Ethyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (10:1:1:1)

+ Phát hiện: - Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm

- Phun thuốc thử AlCl3 5% trong ethanol rồi soi dưới đèn tử ngoại

ở bước sóng 366nm.

Sau khi chiết và tinh chế như trên thu được tinh thể hesperidin màu trắng

với hiệu suất chiết khoảng 1,2% so với dược liệu khơ

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin được tóm tắt trong

sơ đồ ở phụ lục 4.

4.4.2.2. Xác định cấu trúc của chất chiết được

Kết quả phân tích cấu trúc của hesperidin được thể hiện trong phụ lục 7.1.

a. Kết quả của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

Phổ ghi theo phương pháp -MS cho giá trị pic M-H = 609,3 và phổ ghi

theo phương pháp +MS cho giá trị M+H = 610,9

Như vậy phân tử của mẫu có khối lượng là M = 610, tương ứng với công

thức phân tử là C28H34O15, phù hợp với công thức phân tử của Hesperidin.

________________________________________________________________________ 362



Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



b. Kết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

+ Phổ 13C-NMR; DEPT-90; DEPT-135

- Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều cho thấy phân tử mẫu

khảo sát có chứa 28 cacbon bao gồm 2 nhóm –CH3, 2 nhóm –CH2–, 16 nhóm –

CH– và 8 nhóm –C–.

- Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều đã cung cấp một số

thông tin cấu trúc rõ rệt:

+ Pic cacbon bậc 4 ở 197,003 ppm là rất đặc trưng cho cấu trúc ceton

(=C=O).

+ Vùng cacbon bậc 4 gồm 6 pic có độ dịch chuyển hóa học từ 130 đến

165 ppm đặc trưng cho nhân thơm cùng với 3 pic CH ở vùng 112 đến 117ppm

cũng đặc trưng cho nhân thơm cho thấy phân tử mẫu có chứa 2 nhân thơm. Tập

hợp 8 nhóm –CH- có độ dịch chuyển hóa học từ 68 đến 76ppm cùng với 2 pic –

CH- ở 100,595 và 99,454ppm là dấu hiệu chắc chắn về sự tồn tại trong cấu trúc

mẫu 2 phân tử đường. Dấu hiệu trên cùng với sự tồn tại của pic –CH2-OH ở

66,028ppm và pic –CH3 ở 17,820ppm cho phép nhận ra 2 đường có trong cấu

trúc gồm 1 phân tử đường glucose và 1 phân tử đường ramnose.

Như vậy mọi dấu hiệu thể hiện ở bộ phổ 1D-13C-NMR đều phù hợp với

cấu trúc của phân tử hesperidin gồm một khung flavon được thế bởi hai phân tử

đường.

+ Phổ 1H-NMR và phổ HSQC:

Những đặc điểm của một khung flavon có sự thế của 2 phân tử đường

cũng thể hiện rất rõ ở phổ 1H-NMR. Vùng pic từ -6,0 đến 7,0ppm là vòng của –

CH- nhân thơm. Các pic –CH- từ -3,1 đến -5,0ppm là pic –CH- của 2 phân tử

đường. Trong vùng này có sự chen lấn của pic –O-CH3 (δ = 3,773ppm), pic của

một proton trong nhóm –CH2- của vòng B thuộc khung flavon và đặc biệt là

nhiều nhóm –OH của đường. Pic có cường độ rất lớn ở 3,3ppm là pic của dung

môi DMSO. Ở phổ 1H-NMR cũng dễ nhận ra doublet ở 1,083ppm là pic của

CH3 của đường ramnose.

Từ những kết quả của bộ phổ 13C-1D-NMR và 1H-NMR phối hợp với phổ

HSQC có thể dễ dàng nhận ra các pic của 8 nhóm OH trong đó 2 pic đơn ở

12ppm và 9,076ppm là 2 nhóm OH thế ở nhân thơm, còn 6 pic OH còn lại đều

là doublet OH của 2 phân tử đường.

Như vậy kết quả phân tích bộ phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 90,

DEPT120 và HSQC đã cho những nhận xét sơ bộ về sự phù hợp của mẫu đo với

cấu trúc của phân tử hesperidin.

+ Phổ HMBC

Để kiểm tra lại sự chính xác của việc quy kết độ dịch chuyển hóa học cho

các vị trí trong cấu trúc phân tử, phổ HMBC đã được sử dụng. Đặc biệt, với mẫu

được khảo sát, phổ HMBC có vai trò rất quan trọng cho việc xác định vị trí liên

________________________________________________________________________ 363



BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



kết của 2 phân tử đường, vị trí của từng nhóm OH trong tương quan với độ dịch

chuyển hóa học, vị trí của nhóm thế -O-CH3

Bằng kết quả phân tích phổ HMBC, liên kết phân tử (7-1) glucose (61)ramnose, 4’-OCH3, 3’-OH, 5-OH đã được khẳng định.

Từ kết quả phân tích của các phổ trên, chất chiết được khẳng định là

hesperidin với công thức cụ thể là:

OCH 3

O



HO



CH 2



O



O



O



CH 3



O



OH



OH

HO



OH



HO

OH



OH



O



Công thức cấu tạo của hesperidin

Tên

khoa

học:

(2S)-7-[[6-O-Deoxy-α-L-mannopyranosyl]-β-Dglucopyranosyl]oxy] - 2,3- dihydro- 5 -hydroxy-2- (3- hydroxy-4methoxyphenyl)-4H -1 - benzopyran -4-one.

Sự kiểm tra bằng phổ mô phỏng cho kết quả phù hợp.

4.4.2.3. Định tính, thử tinh khiết chất phân lập được bằng các phương pháp

khác

a. Đo nhiệt độ nóng chảy

Chất phân lập được sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, để trong

bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng

chảy. Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 258°C, phù hợp với nhiệt độ nóng

chảy của hesperidin theo lý thuyết là 258 - 262°C [72].

b. Đo phổ hồng ngoại

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ

hồng ngoại của hesperidin chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III. Kết

quả phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của hesperidin

chuẩn (phụ lục 7.1).

c. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với

điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.2.1, đối chiếu với chuẩn hesperidin.

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 3 hệ dung môi, mẫu thử đều cho 1 vết có

cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu hesperidin.

d. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ

lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với chuẩn hesperidin.

________________________________________________________________________ 364



Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic chính có thời gian lưu

tương ứng với pic hesperidin trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hesperidin và

tại thời gian lưu của pic hesperidin, phổ UV thu được của thử và của chuẩn

trùng khớp nhau.



4.4.2.4. Định lượng hesperidin chiết được bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng hesperidin phân lập được bằng phương pháp HPLC

với điều kiện ghi trong dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục 9)

Kết quả: Hàm lượng của hesperidin chiết được tính theo nguyên trạng là

95,0%.

Nhận xét: Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chất phân lập được là

hesperidin với hàm lượng tính theo nguyên trạng khá cao (95,0%) , đạt yêu cầu

của một chất đối chiếu dùng trong phân tích dược liệu. Phương pháp chiết sử

dụng nguyên liệu là Vỏ quýt (Trần bì), một dược liệu rẻ tiền, sẵn có, dung mơi

chiết rẻ tiền, ít độc, dễ kiếm, quy trình chiết khá đơn giản, dễ áp dụng. Hiệu suất

chiết thu được khá tốt ( 1,2 %) nên có thể ứng dụng trong quy mơ lớn hơn. Sản

phẩm hesperidin thu được bằng quy trình chiết đã nêu có thể dùng làm chuẩn để

kiểm tra chất lượng Trần bì và một số dược liệu khác chứa hesperidin.

4.4.3. Chiết tách và tinh chế geniposid từ quả dành dành

4.4.3.1. Chiết tách và tinh chế

Qua tham khảo một số tài liệu [1,25] về tính chất, cách chiết hợp chất

iridoid glycosid cũng như tham khảo một số cách chiết genipin, aglycon của

geniposid trong một số tài liệu [59,91] và bằng nghiên cứu thực nghiệm, chúng

tơi đã chọn được quy trình chiết geniposid từ quả dành dành gồm các bước sau:

− Loại tạp (chất béo, nhựa, chất màu): Dược liệu được phơi khô, tán nhỏ. Lấy

35 g bột dành dành, loại tạp bằng cloroform 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml và

lắc siêu âm 30 phút. Gạn bỏ lớp cloroform. Làm khô bột dược liệu trên cách

thủy.

− Chiết xuất: Thêm 100 ml MeOH vào bột dược liệu đã được loại tạp, lắc siêu

âm 30 phút. Lọc lấy dịch chiết MeOH. Chiết bã như trên thêm 2 lần nữa. Gộp

dịch chiết MeOH

− Cô dịch chiết MeOH trên cách thủy đến vừa cạn

− Thêm vào cắn 200 ml nước, đun nóng trên cách thủy cho tan, thêm 8g than

hoạt đun nóng tiếp trên cách thủy 20 phút, lọc để riêng than hoạt

− Lớp nước lọc được đun tiếp trên cách thủy lần 2 với 2 g than hoạt trong 20

phút để than hoạt hấp phụ hết geniposid còn lại, lọc lấy than hoạt

− Gộp than hoạt chứa geniposid của 2 lần trên

− Giải hấp phụ bằng cách khuấy với MeOH 3 lần, mỗi lần 60 ml, lọc

− Gộp dịch chiết MeOH, cô trên cách thủy đến cạn, thu được 1,2 g cắn

________________________________________________________________________ 365



BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



− Trộn đều 1,2 g cắn với 1 g silica gel (cỡ hạt 0,063 -0,2 mm), nghiền mịn

− Cho hỗn hợp bột vào cột sắc ký đă được chuẩn bị sẵn như đã nêu ở mục 3.4

− Rửa giải lần lượt với:

20 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (95 : 5)

30 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (90 : 10)

40 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (80 : 20)

50 ml hỗn hợp dung môi CHCl3 - MeOH (70 : 30)

− Hứng riêng từng phân đoạn vào các ống nghiệm đã được đánh số thứ tự, mỗi

ống 10 ml. Kiểm tra thành phần mỗi ống bằng sắc ký lớp mỏng.3

Điều kiện sắc ký

+ Dung dịch chuẩn: Hòa tan geniposid chuẩn Trung Quốc trong ethanol để

được dung dịch có nồng độ khoảng 3mg/ml

+ Dung dịch thử: Hòa tan cắn trong ethanol để được dung dịch có nồng độ

khoảng 3 mg/ml.

+ Bản mỏng Silicagel GF254 của Merck

+ Hệ dung môi khai triển:

Hệ 1: Cloroform – methanol – nước - acid acetic (70:30:4:1)

Hệ 2: Ethyl acetat – aceton - acid formic - nước (5:5:1:1)

+ Thuốc thử phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 110°C

cho đến khi hiện rõ vết.

Gộp chung các ống nghiệm có thành phần giống nhau. Những ống ở các

phân đoạn 6,7 ứng với thành phần rửa giải là CHCl3 - MeOH (80:20) chỉ cho 1

vết có màu sắc và Rf giống geniposid chuẩn được gộp chung và để riêng. Các

ống ở phân đoạn khác có chứa geniposid nhưng lẫn các chất khác lại được tiếp

tục cho tách tiếp với các cột silica gel mới cho đến khi thu được phân đoạn chỉ

có 1 vết giống geniposid chuẩn.

- Gộp các ống chứa dịch chiết chỉ có vết giống geniposid, cô trên cách thủy đến

vừa cạn, thu được 1 g cắn geniposid thô.

- Tinh chế: 1 g cắn, thêm 100 ml aceton vào 1 g cắn, đun nóng nhẹ cho tan, lọc

nóng. Cơ dịch chiết aceton trên cách thủy còn khoảng 25 ml, để nguội rồi cho

vào tủ lạnh để ở nhiệt độ khoảng 10°C trong 24 giờ cho kết tinh.

- Lọc qua phễu xốp G3, lấy tủa, rửa bằng aceton, sấy ở 70°C trong 8 giờ, thu

được 0,75g geniposid tinh khiết.

Kết quả: Sau khi chiết và tinh chế như trên thu được bột tinh thể

geniposid màu trắng với hiệu suất chiết khoảng 2,14% so với dược liệu khô.

Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế geniposid được tóm tắt trong sơ

đồ ở phụ lục 6.

4.4.3.2. Xác định cấu trúc của chất chiết được

________________________________________________________________________ 366



Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



Kết quả xác định cấu trúc của geniposid được thể hiện trong phụ lục 7.3

a. Kết quả của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

Để xác định chính xác pic phân tử của mẫu này bằng thiết bị LC-MS,

trong quá trình bắn phá mẫu bằng phương pháp ESI, tác nhân Na+ đã được sử

dụng. Kết quả đã ghi được 1 phổ (phụ lục 7) chỉ chứa pic ion phân tử có giá trị

[M+Na]+ có m/z = 411amu. Như vậy số khối m/z = 411 – 23 = 388 amu. Do z =

1 nên khối lượng phân tử của mẫu đo là M = 388 amu tương ứng với công thức

phân tử là C17H24O10, phù hợp chính xác với cơng thức phân tử của Geniposide.

b. Kết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

+ Phổ 13C-NMR; DEPT-90; DEPT-135

Bộ phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon một chiều (1D-13C-NMR) cho

thấy phân tử mẫu khảo sát gồm 17 cacbon trong đó có 1 nhóm –CH3, 3 nhóm –

CH2-, 10 nhóm –CH- và 3 nhóm –C-. Đặc trưng nổi bật của hệ tín hiệu 13CNMR trong mẫu này là sự có mặt một phân tử đường. 4 pic –CH- từ 69 đến

77ppm là pic của các –CH- trong vòng. –CH- anomeric sẽ là 1 trong 2 pic –CHcó δ = 110,953 hoặc 98,621ppm. Nhóm –CH2- ở δ=60,999 ppm rất đặc trưng

cho –Ch2-OH (6’) của đường. Như vậy đây là phân tử đường glucose. Trong 11

cacbon còn lại, nhóm –CH2- có δ=59,361ppm là –CH2-OH, -CH2- còn lại nằm

trong khung phân tử. Nhóm -CH3 duy nhất ở δ=51,045ppm rất đặng trưng cho

O-CH3. 3 cacbon bậc 4 cũng rất dễ nhận dạng: -C- có δ = 166,941ppm đặc trưng

cho cacbon acid, còn 2 pic còn lại (144,083ppm và 110,953ppm (hoặc

98,621ppm)) là những cacbon bậc 4 chứa nối đôi. Hai pic –CH- ở 151,590 và

125,519ppm chắc chắn là của dạng –CH=.

Như vậy, toàn bộ những đặc trưng nêu trên đều phù hợp với cấu trúc phân tử của

Geniposide.

+ Phổ 1H-NMR và HSQC:

Căn cứ vào cường độ pic được ghi trong phổ 1H-NMR có thể nhận ra sự

có mặt của tồn bộ 25 proton trong phân tử mẫu. Pic có cường độ 3 đơn vị

(3,365) duy nhất là của nhóm –OCH3. Việc có mặt đủ trên phổ tồn bộ 25

prtoton chứng tỏ sự xuất hiện đầy đủ của 5 nhóm –OH. Từ tương quan rút ra

trong phổ HSQC xác định dễ dàng 5 pic –OH, với 3 vạch đôi của 3 nhóm –CHOH ở 5,035, 4,966 và 4,934ppm. Hai nhóm OH vạch 3 còn lại ở 4,719 và

4,467ppm là của 2 nhóm –CH2-OH. Các nhóm chứa hydro còn lại đều thể hiện

rõ ràng mối tương quan C-H và nhờ đó chỉ định được đúng vị trí của các prơtn

trong 3 nhóm –CH2- đều là các proton tương đương.

Kết quả của bộ phổ 1H-NMR và HSQC một lần nữa khẳng định mẫu khảo

sát là phân tử geniposide.

+ Phổ HMBC:

Phổ HMBC đã giúp cho việc xác định vị trí thế của đường, gốc acid,

nhóm –CH2-OH ngồi đường và của nhóm –O-CH3. Kết quả phân tích phổ

________________________________________________________________________ 367



BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



HMBC cho thấy đường liên kết với khung phân tử ở vị trí 1’-1, -CH3 được gắn

với oxy của gốc acid, gốc acid được thế vào khung phân tử ở vị trí 8.

Qua kết quả phân tích các phổ NMR, các số liệu phổ chi tiết đã được xây

dựng và được đưa ra là chính xác và hồn tồn phù hợp với cấu trúc của phân tử

Geniposide (genipin-1-glucoside) sau đây:



Công thức cấu tạo của geniposid

Sự kiểm tra bằng phổ mô phỏng 1H-NMR và 13C-NMR cho kết quả phù hợp.

4.4.3.3. Định tính, thử tinh khiết chất phân lập được bằng các phương pháp

khác

a. Đo nhiệt độ nóng chảy

Chất phân lập được sấy khơ ở 60°C đến khối lượng khơng đổi, để trong

bình hút ẩm có silica gel trong 24 h, nghiền mịn rồi đem xác định nhiệt độ nóng

chảy. Kết quả điểm chảy đo được là khoảng 164°C, phù hợp với nhiệt độ nóng

chảy của geniposid theo lý thuyết là 163°C – 164°C

b. Đo phổ hồng ngoại

Xác định phổ hồng ngoại của chất chiết được, song song xác định phổ

hồng ngoại của geniposid chuẩn Trung Quốc theo phụ lục 3.2, DĐVN III. Kết

quả phổ hồng ngoại của mẫu thử phù hợp với phổ hồng ngoại của geniposid

chuẩn (phụ lục 7).

c. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành phương pháp sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III, phụ lục 4.4 với

điều kiện sắc ký đã được ghi trong mục 4.4.3.1, đối chiếu với chuẩn geniposid

Kết quả: trên sắc ký đồ ở cả 2 hệ dung mơi, mẫu thử đều cho 1 vết có

cùng màu sắc và Rf với vết của mẫu đối chiếu geniposid

d. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo DĐVN III, phụ

lục 4.3 với điều kiện sắc ký đã được ghi trong phần dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục

9), đối chiếu với chuẩn geniposid.

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic chính có thời gian lưu

tương ứng với pic geniposid trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn geniposid và

tại thời gian lưu của pic geniposid, phổ UV thu được của thử và của chuẩn trùng

khớp nhau.

________________________________________________________________________ 368



Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009



4.4.2.4. Định lượng geniposid chiết được bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng geniposid phân lập được bằng phương pháp HPLC

với điều kiện ghi trong dự thảo tiêu chuẩn (phụ lục 9)

Kết quả: Hàm lượng của geniposid chiết được tính theo nguyên trạng là

98,0%.

Nhận xét: Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng chất phân lập được là

geniposid với hàm lượng tính theo nguyên trạng cao (98,0%), đạt yêu cầu của

một chất đối chiếu dùng trong phân tích dược liệu. Phương pháp chiết sử dụng

nguyên liệu là quả Dành dánh, một dược liệu rẻ tiền, sẵn có, dung mơi chiết rẻ

tiền, ít độc, dễ kiếm, quy trình chiết khá đơn giản, dễ áp dụng. Hiệu suất chiết

thu được khá tốt (> 2%) nên có thể ứng dụng trong quy mơ lớn hơn. Sản phẩm

geniposid thu được bằng quy trình chiết đã nêu có thể dùng làm chuẩn để kiểm

tra chất lượng quả Dành dành và một số dược liệu khác chứa geniposid.

Từ 3 chất đã phân lập hesperidin, emodin, geniposid và các kết quả phân

tích trên, chúng tơi đã tiến hành xây dựng dự thảo tiêu chuẩn đối với 3 chất này.

Bản dự thảo tiêu chuẩn được ghi trong phụ lục 9.

5. KẾT LUẬN

Qua 30 tháng thực hiện, đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra và đã

đạt được các kết quả chính như sau:

1. Đã thu thập và định danh được 60 mẫu của 30 dược liệu nghiên cứu:

1



Bạch thược



16 Hạ khơ thảo



2



Bạch truật



17 Hồng đằng



3



Bán hạ



18 Hương phụ (Củ gấu)



4



Cát sâm



19 Kê huyết đằng



5



Chỉ thực



20 Kim ngân hoa



6



Cây Hoa ngũ sắc



21 Mã tiền



7



Cúc gai



22 Mẫu đơn bì



8



Chó đẻ răng cưa



23 Mộc thơng



9



Diệp hạ châu đắng



24 Nghệ



10 Dành dành



25 Ngưu tất



11 Đại hồi



26 Quế



12 Đại hoàng



27 Riềng



13 Đan sâm



28 Sa nhân



14 Địa cốt bì



29 Thăng ma



15 Đương quy



30 Trần bì



________________________________________________________________________ 369



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Phuong phap chiet tach, tinh che emodin, hesperidin va geniposid tu cac duoc lieu nghien cuu de lam chuan

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×