Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
3 TỔNG QUAN L-LACTATE OXIDASE

3 TỔNG QUAN L-LACTATE OXIDASE

Tải bản đầy đủ - 0trang

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH



(LOX) từ các vi sinh vật khác nhau. Trong đó, LOX từ Aerococcus viridans được

quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả. Lox từ các chủng của lồi này đã được tách

dòng, tinh chế, xác định tính chất. Enzym tái tổ hợp của Aerococcus viridans hiện

đã được thương mại hóa trên thị trường bởi các cơng ty hố chất như Sigma

Aldrich, Genzym Diagnostic... Enzym này bao gồm 374 acid amin, có khối lượng

phân tử 44 kDa. L-lactate, D-lactate, glycolate được xác định là cơ chất đặc hiệu

của LOX dưới sự tham gia của FMN (Flavin mononucleotide).

LOX của chủng Lactoccocus lactis subsp. cremoris IFO3427 đã được tinh

sạch và nghiên cứu tính chất. Điểm đẳng điện của enzym được xác định khoảng 4,3

± 0,2. Enzym từ chủng này nhiều đặc điểm tương đồng như enzym từ Aerococcus

viridans, nhưng nó chỉ có khả năng chuyển hóa L-lactate chứ khơng thể chuyển hóa

được D-lactate (Toda và Nishiya, 1998).

LOX có khối lượng phân tử 44.000Da và sử dụng FMN làm cofactor, đặc hiệu cao đối với

L-lactate, D-lactate, glycolate và D, L-2-Hydroxybutyrate khơng bị oxy hố bởi LOX. LOX bị bất

hoạt khi ủ với bromopyruvate (Pernet, 2008).



Cấu trúc tinh thể của LOX được công bố lần đầu tiên năm 1998 bởi Morimoto.

Đến năm 2006, cấu trúc 2.1 Å của LOX từ Aerococcus viridians cũng đã được xác

định và công bố. Trong cấu trúc của LOX 8 tiểu phần protein (A, B, C, D, E, F, G,

H) gắn kết với nhau tạo thành 2 tetramer thể hiện cấu trúc không đối xứng của

enzym. Sự tiếp xúc giữa các tinh thể protein tạo nên các vùng liên kết với kim loại

giữa 2 tetramer (Hình1.8) những vùng này sẽ bị loại bỏ trong q trình biểu hiện và

tinh sạch protein.



SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ



22



KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP



GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH



Hình 1.8. Cấu trúc phân tử của LOX từ A. Viridans (Leiros và cs, 2006)

Bốn tiểu phần protein gắn kết với nhau tạo nên cấu trúc của phân tử LOX thể

hiện một nửa khơng đối xứng của enzym.



Hình 1.9. Vị trí ion Zn giữa hai tetramer của L-lactate oxidase

Ion kim loại gắn kết 2 acid amin là Glu229 và His233 của tiểu đơn vị D và E

(Leiros và cs, 2006).

Vùng liên kết FMN của L-lactate oxidase có vị trí tương tự như ở glycolate

oxidase, nó nằm sâu bên dưới vùng cơ chất dạng phễu, bên cạnh hoặc ở dưới cơ

chất khi nó bị giới hạn. Trong cả 8 tiểu phần L-lactate oxidase cofactor FMN bị uốn



SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ



23



KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP



GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH



cong khoảng 15º quanh các nguyên tử trung tâm, tạo thành hình dạng chữ U cho

nhóm flavin (Leiros và cs, 2006).



1.4 ỨNG DỤNG CỦA LOX ĐỂ CHẾ TẠO BIOSENSOR

1.4.1 Khái quát về biosensor

Biosensor hiện đang là một trong những hướng nghiên cứu nhận được nhiều

sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới. Được công bố lần đầu tiên trên thế giới

bởi Clark và Lyons vào năm 1962 (Palmisano, 2001), biosensor là sự kết hợp giữa

một thành phần sinh học (enzyme, axit nucleic, tế bào, kháng thể) và bộ cảm biến

hóa lý để nhận biết, phân tích một chất nào đó (Palmisano, 2000). Nói cách khác,

biosensor là thiết bị phân tích chuyển đổi một phản ứng sinh học thành tín hiệu

(Hình 1.10). Thuật ngữ "biosensor" thường được sử dụng chung cho các thiết bị

cảm biến dùng để xác định nồng độ các chất và các thông số khác liên quan đến

sinh học, ngay cả khi không sử dụng trực tiếp một hệ thống sinh học (Park, 1997).

*Nguyên lý hoạt động của biosensor:

Chất cần phân tích trong mẫu sẽ đi vào điện cực, sau đó thấm qua màng ngoài

của biosensor. Thành phần sinh học trong bộ thụ cảm (Bioreceptor) sẽ phản ứng với

các chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà bộ biến năng (Transducer) có thể

phát hiện và chuyển nó thành tín hiệu điện. Tín hiệu điện này sẽ được khuếch đại và

xử lý thông qua hệ thống điện tử (Parra, 2006).



SVTH: NGƠ THỊ KIM HÀ



24



KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP



GVHD: THS. DƯƠNG NHẬT LINH



Hình 1.3: Cấu tạo một biosensor (Parra, 2006)



1.4.2 Lactate biosensor

Trước đây L-lactate thường được xác định trong phòng thí nghiệm bằng

phương pháp quang phổ. Tuy nhiên, phương pháp này lại bộc lộ nhiều nhược điểm

như giá thành cao, kỹ thuật phức tạp. Do đó, để đáp ứng với nhu cầu xác định chỉ số

lactate trong các lĩnh vực, đòi hỏi phải phát triển một hệ thống gồm các lactate

biosensor có khả năng phân tích nhanh nhạy, chính xác, độ đặc hiệu cao nhưng nhỏ

gọn, dễ sử dụng và giá thành thấp (Parra, 2006).

Lactate biosensor có thể được thiết kế trên L-lactate oxidase hoặc L-lactate

dehydrogenase. Thậm chí, cytochrome b2 và lactate monooxygenase cũng từng

được sử dụng là nguyên liệu để chế tạo lactate biosensor ở quy mơ nhỏ hơn. Trong

đó, L-lactate oxidase luôn là lựa chọn hàng đầu bởi cơ chế hoạt động của nó đơn

giản, nhạy cảm, phù hợp với nhiều phương pháp thiết kế và dễ dàng tìm thấy ở

nhiều nguồn vi sinh vật. Phương pháp được sử dụng để thiết kế biosensor từ Llactate oxidase rất đa dạng như phương pháp thẩm thấu (Rahman, 2010), xuyên qua

màng (Rassaei, 2013), liên kết cộng hóa trị (Sambrook, 1989), tạo thành dạng



SVTH: NGÔ THỊ KIM HÀ



25



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

3 TỔNG QUAN L-LACTATE OXIDASE

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×