Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

- 200g khoai tây.

- 20g glucose.

- 15g agar.

- 1 lít nước.



23



2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Mốc



Tinh dầu



Khảo sát sự sinh trưởng



Đồng hóa với dung

mơi



Khảo sát sự ảnh hưởng của

tinh dầu lên sự sinh trưởng

của mốc



Chạy sắc kí



Đánh giá độ bền

hệ tinh dầu và

dung môi



Thành phần tinh

dầu



Đánh giá hiệu quả ức

chế của tinh dầu với

mốc



Nồng độ tinh dầu ức chế thích

hợp



Xồi



Xử lý, gây nhiễm

Xử lý tinh dầu

Quan sát, thống kê



Nồng độ tinh bảo quản xồi thích

hợp



Hình 2.4: Qui trình thí nghiệm tổng quát

24



2.2.1. Pha loãng tinh dầu

Tween 80 (Sigma-Aldrich), DMSO (Dimethyl Sulfoxide) (Sigma-Aldrich), Xanthan gum

(Himedia) được pha cùng với nước cất ở các nồng độ 0.5% (v/v), 0.5% (v/v) và 0.05%

(w/v) tương ứng. Các mẫu được hấp tiệt trùng ở 121 0C/15 phút và chuẩn bị cho việc pha

loãng tinh dầu.

Tinh dầu được pha lỗng trong các dung mơi với các nồng độ 100; 75; 50; 20; 10 và 5

µl/mL và được đồng nhất cho đến khi hệ nhũ tương hình thành. Các tinh dầu đã pha lồng

được kiểm tra hiệu quả kháng khuẩn cho các bước tiếp theo.



2.2.2. Đánh giá độ bền của hệ tinh dầu và chất hòa tan tinh dầu

Mục đích: So sánh khả năng hòa tan tinh dầu, độ bền của hệ nhũ tương tinh dầu và dung

mơi, từ đó, chọn ra được những dung mơi tốt nhất, ứng dụng bảo quản xồi. Đồng thời, có

cơ sở để biện luận và bàn luận những kết quả của các thí nghiệm khác.

Cách tiến hành:

Các dung mơi được sử dụng gồm: Tw80 0.5% (v/v), DMSO 0.5%, Xanthan 0.05%. Hút 9

ml mỗi dung môi trên vào ống ngiệm, cho 1 ml tinh dầu vào, sau đó trộn đều hỗn hợp này

trong 5 phút bằng máy votex. Quan sát kích thước hạt tinh dầu trong hệ nhũ dung môi và

tinh dầu bằng kính hiển vi. Đồng thời, quan sát sự tách lớp của các hệ nhũ theo thời gian

để đánh giá khả năng hòa tan tinh dầu của mỗi chất.

Chỉ tiêu đánh giá:

Kích thước của hạt tinh dầu trong mỗi hệ nhũ khi quan sát dưới kính hiển. Thời gian tách

lớp của tinh dầu và dung môi trong mỗi hệ nhũ.



2.2.3. Khảo sát sự sinh trưởng của nấm mốc A.niger và A.fumigatus

Mục đích: Quan sát đại thể, vi thể, đo được tốc độ sinh trưởng của nấm mốc.



25



Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường PDA, hấp khử trùng rồi đổ vào đĩa petri vô trùng.

Thực hiện cấy điểm các chủng mốc lên đĩa, từ đó quan sát và đo kích thước khuẩn lạc của

các chủng mốc qua từng ngày.

Chỉ tiêu đánh giá:

Quan sát đại thể: đánh giá về màu sắc, hình thái mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc, sự

đồng tâm của những khuẩn lạc này.

Quan sát vi thể: dùng kính hiển vi, quan sát hình thái sợi nấm mốc và bào tử của chúng.

Đánh giá về hình dạng, kích thước và những tiêu chí khác (vách tế bào, vách ngăn).

Đo kích thước khuẩn lạc: sau mỗi 24, 48, 72…giờ, đo kích thước khuẩn lạc và ghi nhận.

Từ đó, dựng được đường sinh trưởng của mốc.



2.2.4. Đánh giá hiệu quả ức chế của tinh dầu với mốc

2.2.4.1. Phương pháp MFC

Mục đích: Phương pháp MFC (Minimum fungicidal concentration) nhằm xác định nồng

độ diệt nấm tối thiểu của các loại tinh dầu.

Cách tiến hành: Phương pháp MFC được tiến hành dựa theo nghiên cứu của Devkatte

AN và các cộng sự với một số thay đổi và được tóm tắt như sau [117]. Chuẩn bị ống

nghiệm chứa 8ml PDB, đem hấp khử trùng ở 121 0C/15 phút. Chuẩn bị các dung môi đã

được hấp khử trùng gồm: Tw 80 0.5%, DMSO 0.5%,và Xanthan gum 0.05%. Tinh dầu

được pha loãng trong các dung môi với các nồng độ 0.1; 0.2; 0.5; 0.75; 1; 1.25 và

1.5µl/mL và được đồng nhất cho đến khi hệ nhũ tương hình thành. Dùng micropipet hút

1ml nhũ có chứa tinh dầu cho vào ống nghiệm chứa 8ml PDB. Sau đó thêm vào mỗi ống

nghiệm 1ml bào tử mốc với nồng độ 107 CFU/ml. Để ở nhiệt độ phòng. Các thí nghiệm

được lặp lại 3 lần.



26



Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát sự phát triển của mốc trong mỗi ống nghiệm sau mỗi 24h,

48h và 72h, so sánh với mẫu đối chứng khơng có tinh dầu, đưa ra kết luận về nồng độ diệt

nấm tối thiểu của các loại tinh dầu trong mỗi loại dung mơi.

2.2.4.2. Phương pháp MIC

Mục đích: Phương pháp MIC (Minimum inhibitory concentration) nhằm xác định nồng

độ ức chế tối thiểu của các loại tinh dầu đối với nấm mốc thông qua sự khuếch tán tinh

dầu trên môi trường thạch.

Cách tiến hành: Phương pháp MIC được tiến hành dựa theo nghiên cứu của Tyagi AK và

Malik A với một số thay đổi được tóm tắt như sau [116]. Đổ môi trường PDA đã được hấp

khử trùng ở 1210C/15 phút vào đĩa petri đã được hấp tiệt trùng, mỗi đĩa 15ml. Hút 2ml

bào tử mốc có nồng độ 106CFU/ml phun vào đĩa, tráng đều để dịch bào tử làm thấm ướt

bề mặt thạch. Hút phần dịch lỏng dư ra khỏi đĩa. Chờ bề mặt đĩa khô. Chuẩn bị các dung

môi đã được hấp khử trùng gồm: Tw 80 0.5%, DMSO 0.5%, Xanthan gum 0.05%. Tinh

dầu được pha loãng trong các dung môi với các nồng độ 100; 75; 50; 20; 10 và 5µl/mL và

được đồng nhất cho đến khi hệ nhũ tương hình thành. Hút 10 µl nhũ có tinh dầu nhỏ vào

giữa mỗi đĩa. Ủ ở nhiệt độ phòng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.



27



Tinh dầu



Mốc



Pha loãng thành các nồng độ 10%,

7.5%, 5%, 2%, 1%, 0.5%



Pha lỗng

Gây nhiễm trên đĩa PDA, nồng độ

106CFU/ml



Đồng nhất



Đợi khơ

Nhỏ tinh dầu

Theo dõi trong 24h, 48h



Vòng tròn kháng mốc



Hình 2.5: Quy trình khảo

Chỉ tiêu đánh giá: Đo đường kính vòng kháng nấm hình thành sau mỗi 24 giờ và 48 giờ,

nồng độ tinh dầu thấp nhất có hình thành vòng kháng nấm là MIC.

2.2.4.3. Phương pháp xơng hơi tinh dầu

Mục đích: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các loại tinh dầu đối với nấm mốc

thông qua pha hơi. So sánh hiệu quả ức chế của tinh dầu đối với nấm mốc ở 2 phương

pháp: khuếch tán thạch và xông hơi.

Cách tiến hành: Phương pháp xông hơi tinh dầu thực hiện theo như mô tả của Lopez

cùng các cộng sự và theo nghiên cứu của Tyagi cùng các cộng sự với một số thay đổi

được tóm tắt như sau [69, 118]. Đổ môi trường PDA đã được hấp khử trùng ở 121 0C/15

phút vào phần đáy của đĩa petri đã được hấp tiệt trùng, mỗi đĩa 15ml. Hút 2ml bào tử mốc

28



có nồng độ 106CFU/ml phun vào đĩa, tráng đều để dịch bào tử làm thấm ướt bề mặt thạch.

Hút phần dịch lỏng dư ra khỏi đĩa. Chờ bề mặt đĩa khô. Chuẩn bị các dung môi đã được

hấp khử trùng gồm: Tw 80 0.5%, DMSO 0.5% và Xanthan gum 0.05%. Tinh dầu được

pha lỗng trong các dung mơi với các nồng độ 100; 75; 50; 20; 10 và 5µl/mL và được

đồng nhất cho đến khi hệ nhũ tương hình thành. Phần nắp có dán giấy thấm, tinh dầu

được tẩm vào giấy thấm này với thể tích 10 µl. Bao kín đĩa bằng màng bao thực phẩm, lật

ngược đĩa để hơi tinh dầu bay lên. Ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát và đo vòng kháng nấm

sau mỗi 24 giờ và 48giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Chỉ tiêu đánh giá: Đo đường kính vòng kháng nấm hình thành sau mỗi 24h và 48h, nồng

độ tinh dầu thấp nhất có hình thành vòng kháng nấm là MIC. Nồng độ tinh dầu = lượng

tinh dầu nguyên chất (µl)/Thể tích khơng khí (ml).



Hình 2.6: Phương pháp xơng hơi tinh dầu ở đĩa petri

2.2.4.4. Phương pháp ức chế hệ sợi

Mục đích: Đánh giá khả năng ức chế hệ sợi của nấm mốc của các loại tinh dầu.

Cách tiến hành: Phương pháp ức chế hệ sợi thực hiện theo như mô tả Guo và cộng sự

với một số thay đổi được tóm tắt như sau [119]. Chuẩn bị ống nghiệm chứa 9ml PDA,

đem hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Chuẩn bị các dung môi đã được hấp khử trùng gồm:

Tw 80 0.5%, DMSO 0.5%, Xanthan gum 0.05%. Tinh dầu được pha lỗng trong các dung



29



mơi với các nồng độ 0.64; 0.32; 0.16 và 0.08 µl/mL và được đồng nhất cho đến khi hệ

nhũ tương hình thành. Dùng micropipet hút 1ml nhũ có chứa tinh dầu cho vào ống

nghiệm chứa 9ml PDA rồi trộn đều bằng máy votex. Đổ vào đĩa petri vơ trùng có đường

kính 90mm. Bào tử nấm mốc được cấy vào giữa mỗi đĩa và được ủ ở nhiệt độ phòng. Đo

đường kính của khuẩn lạc sau mỗi 24h. Các thí nghiệm được đánh giá khi nấm phát triển

đến mép của đĩa. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Tiêu chí đánh giá: Đo kích thước khuẩn lạc sau mỗi 24h. Chỉ số kháng nấm (AI) được

tính dựa trên phương trình AI(%) = (1-D 1/D2)x100, trong đó D1 là kích thước của khuẩn

lạc trong đĩa thí nghiệm, D2 là kích thước của khuẩn lạc trong đĩa đối chứng [119]. Kết

qua thu được là trung bình cộng của 3 mẫu lặp lại.



2.2.5. Đánh giá hiệu quả bảo quản xoài bằng tinh dầu quế

Mục đích: đánh giá khả năng bảo quản xồi bằng phương pháp phun và xơng hơi tinh

dầu quế ở nồng độ ức chế tối thiểu tìm được ở thí nghiệm MIC cũng như nồng độ ức chế

tối thiểu ở phương pháp xông hơi tinh dầu.

2.2.5.1. Trường hợp xử lý tinh dầu sau khi gây nhiễm

Cách tiến hành:

Xoài



Rửa sạch, ngâm muối,

lau cồn



Gây nhiễm



Xử lý tinh dầu



Đợi khô



Theo dõi



Nồng độ khả thi



Hình 2.7: Quy trình thử nghiệm tính kháng mốc của tinh dầu quế trên xoài



30



Phần xử lý tinh dầu chia thành các trường hợp sau đây:



Xử lý tinh dầu



Phun



Có tạo vết

thương



Xơng



Khơng tạo

vết thương



Có tạo vết

thương



Khơng tạo

vết thương



Mơ tả quy trình thí nghiệm: Xồi được hái tại vườn. Sau khi vận chuyển đến phòng thí

nghiệm, sẽ được lựa chọn, phân loại để chọn ra những quả còn xanh, kích thước đồng

đều, không bị sâu bệnh, không bi tổn thương cơ học sau q trình vận chuyển. Xồi được

rửa sạch, sau đó ngâm với nước muối sinh lý (NaCl 0.9%). Sau 30 phút, vớt xồi, lau khơ

rồi xử lý bằng cồn 700 [120]. Đến đây, xoài được chia làm 2 phần: có tạo vết thương và

khơng tạo vết thương. Phần có tạo vết thương được thực hiện như mô tả của tác giả

Nguyễn Duy Lâm và Nguyễn Minh Nguyệt với một số thay đổi được tóm tắt như sau: sau

khi xử lý cồn, đợi bề mặt quả xồi khơ, dùng dao lam vô trùng rạch thành các đường song

song. Trên mỗi quả, có 6 vết thương, mỗi vết thương có 5 rạch [105]. Sau đó, cấy dịch

bào tử nấm mốc có nồng độ 106CFU/ml. Đối với phần không tạo vết thương, ta chỉ xử lý

cồn rồi chờ cho khô, rồi phun dịch bào tử có nồng độ 10 6CFU/ml lên bề mặt trái.Tiếp tục

chờ khơ, sau đó đem đi xử lý tinh dầu.

Chuẩn bị các dung môi gồm: Tw 80 0.5%, DMSO 0.5% và Xanthan gum 0.05%. Pha tinh

dầu vào dung môi với nồng độ 10% và 0.5%.

Phần xử lý tinh dầu, chia làm 2 phần: xông và phun.



31



Phần xông được thực hiện như mô tả của Andriana Stavropoulou và cộng sự với một

số thay đổi được tóm tắt như sau: chuẩn bị những hũ nhựa, rửa sạch, lau khô. Cắt giấy lọc

thành những tấm hình vng có kích thước 3.5cm x 3.5cm. Đặt tấm giấy lọc vào một

miếng đĩa petri, đặt miếng đĩa này vào trong hũ, nhỏ nhũ có tinh dầu nồng độ 10% vào

tấm giấy lọc với thể tích được tính tốn sao cho nồng độ đạt 32ppm và 64ppm đối với

A.fumigatus và đạt 64ppm và 128ppm đối với A.niger . Sau đó, để xồi vào bên trong.

Đậy nắp kín trong vòng 2 giờ rồi lấy ra, cất vào bao PE [121].

Phần phun: dùng nhũ có tinh dầu nồng độ 0.5% phun đều lên mề mặt trái.

2.2.5.2. Trường hợp xử lý tinh dầu trước khi gây nhiễm

Cách tiến hành:

Xồi



Rửa sạch, ngâm muối,

lau cồn



Xử lý tinh dầu



Gây nhiễm



Đợi khơ



Theo dõi



Nồng độ khả thi



Hình 2.8: Quy trình thử nghiệm tính kháng mốc của tinh dầu quế trên xoài

Thực hiện tương tự như trường hợp xử lý tinh dầu sau khi gây nhiễm, chỉ khác ở chỗ, xử

lý tinh dầu xong, sau đó mới cấy hoặc phun dịch bào tử mốc lên trái xồi.

Ngồi ra, còn chuẩn bị các mẫu đối chứng. Mẫu đối chứng là mẫu gây nhiễm với bào tử

mốc ở cả hai trường hợp có tạo vết thương và không tạo vết thương với nồng độ bào tử

106CFU/ml . Nhưng không đem xử lý tinh dầu.

Tất cả các mẫu được thực hiện lặp lại 2 lần.

Tiêu chí đánh giá:



32



Đối với mẫu có tạo vết thương: đếm số vết thương có nấm phát triển 2 ngày mỗi lần, rồi

tính tỉ lệ phần trăm theo tổng số vết cấy [105].

Đối với mẫu không tạo vết thương: ước lượng độ hư hỏng thơng qua diện tích bề mặt quả

bị mốc hoặc bị hư hỏng, tính theo phần trăm.



Hình 2.9: Tạo vết thương trên xoài



2.2.6. Xử lý số liệu thống kê

Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsolf Excel, xác định sự sai khác

trung bình bằng phân tích phương sai ANOVA, có ý nghĩa với độ tin cậy p < 0.05.



2.2.7. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Các thí nghiệm ở nghiên cứu này được tiến hành ở Trung tâm thí nghiệm thực hành,

Trường Đại Học Cơng Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Thời gian tiến hành thí nghiệm từ

tháng 9/2015 đến tháng 6/2016.



33



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×