Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
KẾT QUẢ NHẬN XÉT

KẾT QUẢ NHẬN XÉT

Tải bản đầy đủ - 0trang

Hình 11 .Nấm mốc Mucor quan sát dưới kính hiển vi



 Rhizopus sp.

– Bào tử kín, đơn bào

– Khuẩn ty khơng phân nhánh, khơng có vách ngăn

– Có rễ giả



25



Hình 12. Nấm mốc Rhizopus quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x



Hình 13. Nấm mốc Rhizopus quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x



 Aspergillus

– Bào tử hở, đa bào

– Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn

– Hình bơng cầu, có những chuỗi tua ra

26



Hình 14. Nấm mốc Aspergillus quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 10x



Hình 15. Nấm mốc Aspergillus quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x



 Penicillium



27













Bào tử hở, đa bào

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn

Cộng bào tử phân nhánh

Chuỗi đính bào tử.



Hình 16. Nấm mốc Penicillium



5. ỨNG DỤNG

 Mucor thường sử dụng ttrong sản xuất chao, nước tương, người ta sử dụng Mucor

để lên men đậu hũ, khi đó nó sẽ tiết ra enzyme để chuyển biến protein, chất béo,

glucid trong đậu thành những phân tử đơn giản như acid amin, acid béo, các

đường đơn. Như vậy chao có mùi thơm đặc biệt. Ngày nay để hạn chế khả năng

tạp nhiễm gây hư hỏng chao, người ta tiến hành phân lập và sản xuất bột bào tử

Mucor.sp để sản xuất.

 Rhizopus là nấm sợi được tìm thấy nhiều trên trái cây hay rau quả bị thổi rữa, phân động

vật và trên bánh mì. Đây là loại gây bệnh phổ biến, chúng là nguyên nhân gây các bệnh

nhiễm trùng nguy hiểm thậm chí chết người. Bên cạnh đó, Rhizopus sp. được ứng dụng

trong sản xuất chao và temped (là một bánh thu được từ phương pháp lên men bề mặt với

nấm R. oligosporus của những hạt đậu).

 Penicillium là một chi nấm có tầm quan trọng lớn trong môi trường tự nhiên cũng như

sản xuất thực phẩm và thuốc.

Vài thành viên của chi được dùng để sản xuất penicillin - một kháng sinh có thể giết

chết hoặc ngừng sự phát triển của một số loại vi khuẩn trong cơ thể.

Vài lồi được dùng để làm pho mát, ví dụ Phó-mát Camembert.

Sản xuất Amylase từ Aspergillus oryzae



28



Một số lồi nấm sợi thường được sử dụng để sản xuất sinh khối protein. Mốc

Aspergillus oryzae được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước, như sản xuất nước tương (xì

dầu), súp miso và rượu sake ở Nhật Bản hay làm tempeh ở Java.

Mốc hoa cau được dùng để sản xuất tương, loại thực phẩm phổ biến ở Việt Nam,

cũng chính là Aspergillus oryzae, tuy nhiên tương sản xuất thủ cơng lại có độ an tồn

khơng cao, bởi những loại mốc tốt và không độc như Aspergillus oryzae và Aspergillus

sojae lại rất dễ lẫn lộn với những loại mốc nguy hiểm có độc tố gây ung thư khác là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.

 Thành phần thức ăn và gia vị có nguồn gốc từ nấm mốc.

 Làm giàu thêm đạm cho thực phẩm tinh bột và thức ăn gia súc.



29



BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

1. MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

• Nắm vững hơn, hiểu và vận dụng được các phương pháp định lượng vi sinh vật

• Xác định số khuẩn lạc trong 1 ml mẫu ban đầu.

2. SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT

Phương pháp định lượng vi sinh vật là các phương pháp xác định số lượng vi sinh vật

trong mẫu. Hiện nay có rất nhiều phương pháp vừa để định lượng vi sinh vật trong các

canh trường lên men nhằm mục đích theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong quá

trình ni cấy.

Có 7 phương pháp định lượng vi sinh vật. Phương pháp trực tiếp gồm phương pháp

đếm khuẩn lạc, phương pháp vi lọc (màng lọc), phương pháp MPN, phương pháp đếm

trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Phương pháp gián tiếp gồm phương pháp đo độ

đục, phương pháp đo hoạt độ trao đổi chất, phương pháp khối lượng khô.

2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Bản chất của phương pháp này là cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật

lên môi trường thạch trong hộp petri. Môi trường được chọn có thành phần cơ chất đặc

trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định lượng phát triển.

Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc

và ta có thể quan sát bằng mắt thường.

Nếu loài vi sinh vật là đơn bào, dạng riêng lẻ thì ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết

quả của sự phát triển từ một tế bào. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy

và hệ số pha lỗng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo sát ban đầu.

 Ưu điểm: cho phép xác định số tế bào sống, định lượng chọn lọc vi sinh vật. Đây là

phương pháp định lượng vi sinh vật chính xác nhất, được sử dụng rộng rãi hơn các

phương pháp khác.

 Nhược điểm: thời gian dài, tốn kém chi phí hóa chất, cần nhiều nhân cơng

 Phương pháp:

• Chuẩn bị dịch pha lỗng mẫu

• Chuẩn bị các chuỗi pha lỗng mẫu

• Cấy mẫu vào mơi trường, ủ mẫu

• Đếm khuẩn lạc hình thành

 Gồm 2 phương pháp: phương pháp đổ đĩa và phương pháp cấy bề mặt

- Phương pháp đổ đĩa:

+ Ưu điểm: cấy được thể tích mẫu lớn (1 ml), xác định được các VSV cần dinh dưỡng

tiếp xúc từ nhiều phía, cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn

lạc.

+ Nhược điểm: Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt, không xác định

được hình dạng khuẩn lạc nhất định, khó làm thuần một dòng VSV.

- Phương pháp cấy bề mặt:



30



+ Ưu điểm: định lượng được các VSV nhạy nhiệt, có thể nhận dạng được dạng khuẩn

lạc đặc trưng, dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu.

+ Nhược điểm: Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ , chỉ cho phép đếm được số lượng

khuẩn lạc thấp.

2.2. Phương pháp vi lọc

Dùng một màng lọc có kích thước nhỏ hơn 1 micromet, đảm bảo thu được vi sinh vật.

Đặt màng lọc lên mơi trường, sau đó bảo quan trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh

vật phát triển thành khuẩn lạc, ta đếm số lượng khuẩn lạc đó.

 Ưu điểm: xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn 10 ml,

100 ml,…

 Nhược điểm: khơng thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn, dùng cho

dung dịch có độ nhớt cực kỳ thấp, khơng có cấu tử lơ lửng, mật độ vi sinh vật thấp.

2.3. Phương pháp MPN

Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các

độ pha loãng khác nhau của mẫu. Hệ số pha loãng được chọn 100, 10-1, 10-2,…

Mỗi độ pha lỗng được ni cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần).

Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính

và có một số lần âm tính. Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê

 giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.

 Ưu điểm: định lượng được vi sinh vật trong các mẫu có nồng độ thấp (nhỏ hơn 100 tế

bào/ml hoặc g).

 Nhược điểm: cần thêm khoảng thời gian pha loãng mẫu, thao tác phức tạp hơn, tốn thời

gian tra bảng MPN

2.4. Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu

Đếm các vi sinh vật ở dạng đơn bào, đứng riêng lẻ và có kích thước lớn (vài

micrometer) để định lượng số tế bào trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng để đếm

một số loài nấm men và vi khuẩn. Thường được sử dụng để theo dõi sự sinh trưởng của

vi sinh vật trong các q trình lên men thực hiện trên mơi trường lỏng.

 Ưu điểm: cho biết được số lượng vi sinh vật, đếm được nhanh

 Nhược điểm: dễ nhầm lẫn, độ chính xác khơng cao, khơng thích hợp cho huyền phù vi

sinh vật có mật độ thấp, khơng được áp dụng để kiểm tra hàm lượng vi sinh vật trong các

mẫu thực phẩm.

2.5. Phương pháp đo độ đục

Độ đục của dịch tế bào có thể đếm bằng quang phổ kế và được biểu diễn bằng đơn vị

hấp thụ.

Số lượng tế bào liên quan mật thiết với độ đục của dịch vi khuẩn.

Tế bào phải được khuấy chọn kĩ trước khi đưa vào quang phổ kế.

Đo độ đục của dịch treo tế bào. Đây là phương pháp rất thuận lợi, trong thực tế ta

thường đo mật độ quang học của dịch treo (dịch huyền phù).

31



Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường.

Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong nước tỷ lệ

tuyến tính với độ đục của mơi trường.

Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu.

Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và

số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp.

 Ưu điểm: chính xác, thường dùng trong nghiên cứu

 Nhược điểm: tốn chi phí cho thiết bị, phải lập đường chuẩn, môi trường không thay đổi.

2.6. Phương pháp đo hoạt độ trao đổi chất (ATP)

Để xác định được hàm lượng ATP nội bào, trước tiên ta cần phá vỡ thành tế bào để

trích ly ATP. Hiện nay người ta sử dụng những enzyme đặc hiệu để xúc tác phản ứng

phân hủy các đại phân từ tham gia cấu tạo nên thành tế bào. Tiếp theo dựa vào phản ứng

quang sinh học giữa ATP và luciferin, sử dụng xúc tác là luciferase để định lượng ATP.

Cứ một phân tử ATP tham gia phản ứng sẽ giải phóng một photon. Cường độ ánh

sáng phát ra được xác định ở bước sóng 562nm. Cường độ ánh sáng phát ra tỷ lệ thuận

với hàm lượng ATP tham gia phản ứng . Bằng cách dựng đồ thị đường chuẩn, ta có thể

định lượng được hàm lượng ATP có trong mẫu phan tích.

Điều kiện tối thích để phản ứng phát quang sinh học của ATP diễn ra là ở pH 7.6,

nhiệt độ 20 – 220C.

 Ưu điểm: phỏng đoán được hàm lượng các tế bào vi sinh vật sống có trong mẫu

 Nhược điểm: phải dựng đồ thị đường chuẩn, cần nhiều thời gian

2.7. Phương pháp xác định khối lượng khô

 Nguyên tắc: Ly tâm  Rửa  Sấy

Thu hồi nấm men trong dịch bằng phương pháp vi lọc hoặc ly tâm  Rửa bằng

dung dịch xút để tách bỏ các chất hữu cơ bám trên bề mặt  Sấy đến trọng lượng

khơng đổi

Kết quả sẽ được tính tốn và biểu diễn dưới dạng số g chất khơ sinh khối có trong

1 lít mẫu khảo sát

 Ưu điểm: có thể tiến hành trong cả quy mơ phòng thí nghiệm lẫn quy mô sản xuất đẻ

theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong quá trình lên men.

 Nhược điểm: tốn thời gian, phải tiến hành nhiều giai đoạn, phức tạo hơn, không sử

dụng trong đinh lượng vi sinh vật thực phẩm.

3. Cách tiến hành

• Pha lỗng mẫu

Đối với mẫu lỏng, dùng pipet man hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa

9 ml dung dịch nước cất đã tiệt trùng, lắc trộn, khi đó ta sẽ có nồng độ pha loãng là 10 1



+ Tiếp tục từ ống 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất đã tiệt

trùng khác, lắc trộn, khi đó ta được nồng độ pha loãng 10-2.

32



+ Tiếp theo từ ống 10-2 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất đã tiệt

trùng khác, lắc trộn, khi đó ta được nồng độ pha lỗng 10-3.

+ Tiếp tục như vậy đến nồng độ pha loãng là 10-5.

• Đổ mơi trường đã chuẩn bị ở bài 1 sau khi đồng hóa thành lỏng vào 4 hộp petri, đậy

nắp để nguội và đơng đặc.

• Dùng pipet man hút 0.2 ml mỗi mẫu (1 mẫu 10 -3, 2 mẫu 10-4 , 1 mẫu 10-5) đã pha

loãng như trên vào từng hộp petri đã chứa thạch đông đặc. Dùng que chan dàn đều

*Chú ý: Phải thực hiện trong môi trường xung quanh hộp petri có đèn cồn cháy để

tránh nhiễm khuẩn

• Bao kín hộp petri bằng màng bọc thực phẩm, úp ngược và để trong tủ ấm ở nhiệt độ

thích hợp trong vòng 48 – 72 giờ, sau đó lấy ra quan sát và đếm khuẩn lạc.

4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT



Nồng độ 10-4



Nồng độ 10-3



Hình 17. Định lượng vi sinh vật



- Nồng độ pha loãng 10-3: 157 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng đục xung quanh có

những vòng phân giải trong suốt, nhiều khuẩn lạc riêng rẽ hơn nồng độ pha loãng 10 4

, những khuẩn lạc riêng rẽ đó thường có hình tròn.

- Nồng độ pha lỗng 10-4: 52 khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc ít hơn, ít khuẩn lạc đơn lẻ

hơn, nhiều khuẩn lạc dạng đôi, dạng tứ. Do thao tác khi cho 0.2 mml mẫu pha lỗng

vào, chưa dàn đều nên các khuẩn lạc khơng mọc đều trên mặt thạch, chỗ nhiều lượng

mẫu khuẩn lạc mọc thành chùm, chỗ ít lượng mẫu hoặc thậm chí khơng có thì khuẩn

lạc khơng mọc.

- Còn lại 1 mẫu nồng độ pha loãng 10 -3 và 10-5 bị nhiễm  bị mốc: khuẩn lạc không

mọc. Do khi hơ xung quanh miệng hộp petri trước khi mở nắp chưa kỹ hoặc que

trang tiệt trùng chưa kỹ, hay lúc dàn đều mẫu trong hộp petri sơ ý để hộp petri ra xa

đèn cồn dẫn đến bị nhiễm từ môi trường xung quanh.

 Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm

vi sinh vật vào môi trường thạch. Khi tiến hành đổ thạch và cho mẫu vào phải thực

hiện trong phạm vi khử khuẩn của đèn cồn.

 Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha lỗng tránh gây lẫn lộn.



33



 Tính số khuẩn lạc trong 1 ml mẫu

Ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 đến 250. Số

khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu cho từng độ pha loãng là:

Ở độ pha loãng 10-3, số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri là 157. Số khuẩn lạc có

trong 1ml mẫu ban đầu là:

157

= 157.103

−3

1× 10



(khuẩn lạc)

Ở độ pha lỗng 10 , số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri là 52. Số khuẩn lạc có

trong 1ml mẫu ban đầu là:

-4



52

= 52.103

−3

1× 10



(khuẩn lạc)

Vì chênh lệch giữa và lớn hơn 2 lần nên sử dụng độ pha lỗng nhỏ hơn để tính tốn.

Vậy, Số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu là: 157.103 khuẩn lạc.

5. ỨNG DỤNG

– Ứng dụng rộng rãi trong kiểm tra thực phẩm, bệnh phẩm, chất lượng vi sinh của

H2O. Độ nhạy khá cao, cho phép xác định tương đối chính xác mức độ nhiễm

khuẩn đối với sản phẩm. Tuy nhiên, thời gian dài và tốn kém chi phí hóa chất. Sử

dụng nhân cơng nhiều hơn phương pháp khác: phương pháp đo độ đục, màng lọc,



– Định lượng vi sinh vật nhằm xác định số lượng các vi sinh vật có lợi cũng như có

hại trong sản phẩm: E.coli, Samonella, tổng số vi sinh vật hiếu khí…

– Dựa vào số lượng vi sinh vật, thử nghiệm, tìm ra phương pháp hay môi trường tối

ưu cho sự phát triển của vi sinh vật có lợi cũng như hạn chế lượng vi sinh vật gây

hại.



34



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

KẾT QUẢ NHẬN XÉT

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×