Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
BÀI 7: GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

BÀI 7: GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Tải bản đầy đủ - 0trang

Nuôi cấy các tế bào trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc

riêng rẽ.

120.

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các

bước:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập các vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của vi sinh vật

121.

b. Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:

- Phương pháp đồ đĩa

- Phương pháp dàn đều

- Phương pháp cấy ria

3

Các phương pháp giữ giống vi sinh vật

a. Nguyên tắc:

- Các chủng vi sinh vật thuần khiết sau khi phân lập được cần được

phải bảo quản ở điều kiện tối ưu sao cho sau thời gian bảo quản

chúng vẫn ở trạng thái hoạt động và giữ được hoạt tính khơng bị thay

đổi.

- Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm

thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.

- Làm chậm q trình trao đổi chất và hơ hấp ở vi sinh vật đồng thời

ngăn cản quá trình sinh sản của chúng.

b. Các phương pháp:

122.

Các phương pháp cấy chuyền:

Cấy chuyền định kỳ:

123.

- Phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh

vật. Với nấm men, vi khuẩn cấy chuyền sau 1-2 tháng, với nấm mốc cấy

chuyền sau 3-6 tháng. Thời gian giữa 2 lần cấy có thể kéo dài hơn nếu

sau khi cấy vi sinh vật bảo quản ở nhiệt độ thấp (3-5ºC).

124.

Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm.

125.

Nhược điểm: tốn môi trường, công sức, thời gian, thời gian bảo

quản không lâu.

126.

- Tính chất ban đầu của giống có thể bị thay đổi do nhiều

nguyên nhân khó xác định cụ thể trong quá trình cấy chuyền.

127.

- Bảo quản dưới dầu: paraffin phủ trên lớp thạch nghiêng sẽ

giúp ngăn cản sự bay hơi nước của môi trường nuôi cấy vi sinh vật và

làm chậm tốc độ phát triển của vi sinh vật nhờ hạn chế O2.

128.

- Bảo quản trong nước: Cắt một khối agar 6mm từ rìa khuẩn

lạc. Đặt khối agar đó vào trong ống nghiệm có chứa nước cất vơ khuẩn,

đậy chặt nắp ống nghiệm và bảo quản ở 25ºC

Phương pháp đông khô:

129.

- Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do.

Đồng thời làm giảm, thậm chí ngừng hẳn quá trình phân chia của vi

sinh vật. Nhờ đó chúng chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh

-



41



- Phương pháp này dùng nhiều trong sản xuất, thời gian bảo

quản lên tới vài chục năm.

Phương pháp sấy khô

131.

- Sấy khô làm giảm sự trao đổi chất của vi sinh vật. Tế bào hay

bào tử vi sinh vật có thể được sấy khơ bằng cách thổi khơng khí, bằng

các chất hút ẩm như silica gel hay đất hay bằng phương pháp đơng cơ.

Thường bào tử có hàm lượng nước thấp hơn so với tế bào dinh dưỡng và

chịu được điều kiện khô tốt hơn.

Phương pháp bảo quản ở nhiệt độ lạnh đông

132.

- Hạ thấp nhiệt độ môi trường nuôi cấy vi sinh vật sẽ làm giảm

quá trình trao đổi chất cho tới khi nó dừng hẳn khi tồn bộ nước trong

tế bào vi sinh vật bị đóng băng. Dưới -70ºC, hầu như khơng còn có sự

trao đổi chất nào của vi sinh vật. Tuy nhiên sự thay đổi cấu trúc tinh thể

đá vẫn có thể xảy ra ở nhiệt độ -135ºC. Bởi vậy, bảo quản vi sinh vật ở

nhiệt độ nito lỏng (-196ºC) là phương pháp bảo quản an toàn nhất hiện

nay đang được sử dụng.

133.

- Chuẩn bị hỗn hợp vi sinh vật trong 10% glycerol vô khuẩn

134.

Dung dịch glycerol có độ nhớt cao, tránh hiện tượng co cụm

của các tế bào với nhau, nhiệt độ đông đặc rất thấp, ở nhiệt độ thấp,

các tế bào vi sinh vật vẫn tách rời nhau  bảo quản được lâu hơn.

135.

- Cho 0.5 ml hỗn hợp trên vào ống nghiệm bằng nhựa đã vô

khuẩn

136.

- Làm lạnh ống nghiệm xuống -50 ºC với vận tốc làm lạnh thích

hợp cho từng lồi vi sinh vật

137.

- Khi nhiệt độ hỗn hợp đã hạ thấp xuống -50ºC, đặt ống

nghiệm vào nito lỏng,

138.

- Ngoài nito lỏng, vi sinh vật có thể được bảo quản ở nhiệt độ

cao hơn như -20ºC, -40ºC, tuy nhiên nhiệt độ càng cao thì thời gian bảo

quản càng ngắn và vi sinh vật càng dễ mất hoạt tính.

3 CÁCH TIẾN HÀNH

1

Phân lập nấm men bằng phương pháp đổ đĩa

− Cho 3 ống nghiệm ½ chứa môi trường Hansen đặc vào bể điều nhiệt ở

100°C để hóa lỏng. Để nguội về nhiệt độ phòng đến 50°C.

− Pha loãng mẫu nấm men ở các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5. Cho

0,1ml mỗi mẫu lần lượt vào 3 đĩa petri khuẩn bằng micropipet.

− Đổ môi trường đã nguội vào mỗi đĩa petri, xoay nhẹ trên bề mặt

phẳng để mẫu được trải đều trong môi trường.

− Chờ cho môi trường đông hẳn, lật úp đĩa petri lại, tiến hành bao gói và

đưa vào tủ ấm để ni cấy ở nhiệt độ 30-33°C trong khoảng 2-3 ngày.

2

Cấy chuyền nấm men

a. Từ canh trường lỏng sang môi trường lỏng:

- Cầm que cấy ở tay phải (tay thuận), ống nghiệm chứa canh trường

nấm men ở tay trái.

130.



42



Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội.

Dùng ngón út tay phải kẹp nút bơng ống nghiệm chứa canh trường

vào lòng bàn tay, hơ đầu ống nghiệm và nút bông gần ngọn lửa đèn

cồn.

- Đưa que cấy vào lấy đủ một vòng canh trường, hơ lại đầu ống

nghiệm và nút bông rồi đậy ống nghiệm lại.

- Bỏ ống nghiệm chứa canh trường xuống, lấy ống nghiệm chứa môi

trường lên.

- Tiếp tục gỡ nút bông ống nghiệm chứa môi trường, hơ đầu ống

nghiệm và nút bông, đưa que cấy chứa canh trường vi sinh vật vào

bên trong môi trường xoay nhẹ rồi lấy ra, hơ đầu ống nghiệm và nút

bông rồi đậy ống nghiệm lại.

- Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiêu diệt vi sinh vật còn lại

trên que cấy.

- Đưa ống nghiệm chứa mơi trường vào tủ ấm để nuôi cấy ở nhiệt độ

30-33°C trong 2-3 ngày.

-



139.



140.



Hình 7-23 Cấy truyền lỏng sang lỏng.



b. Từ canh trường lỏng sang môi trường thạch nghiêng

- Cầm que cấy ở tay phải (tay thuận), ống nghiệm chứa canh trường

-



-



nấm men ở tay trái.

Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội.

Dùng ngón út tay phải kẹp nút bông ống nghiệm chứa canh trường

vào lòng bàn tay, hơ đầu ống nghiệm và nút bơng gần ngọn lửa đèn

cồn.

Đưa que cấy vào lấy đủ một vòng canh trường, hơ lại đầu ống

nghiệm và nút bơng rồi đậy ống nghiệm lại.



43



Bỏ ống nghiệm chứa canh trường xuống, lấy ống nghiệm chứa môi

trường lên.

- Tiếp tục gỡ nút bông ống nghiệm chứa môi trường, hơ đầu ống

nghiệm và nút bông, đưa que cấy gần sát xuống đáy ống thạch

nghiêng, tiến hành vẽ những đường zigzag trên bề mặt thạch từ dưới

đáy dần dần trở ra miệng ống, hơ đầu ống nghiệm và nút bông rồi

đậy ống nghiệm lại.

- Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiêu diệt vi sinh vật còn lại

trên que cấy.

- Đưa ống nghiệm chứa môi trường vào tủ ấm để nuôi cấy ở nhiệt độ

32°C trong khoảng 2-3 ngày.

c. Từ canh trường đặc sang môi trường thạch nghiêng

- Cầm que cấy ở tay phải (tay thuận), ống nghiệm chứa canh trường

và môi trường đặc ở tay trái.

- Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội.

- Dùng ngón út tay phải kẹp nút bơng ống nghiệm chứa canh trường

vào lòng bàn tay, hơ đầu ống nghiệm và nút bông gần ngọn lửa đèn

cồn.

- Đưa đầu que cấy vào ống canh trường đặc, lấy một khuẩn lạc trên

bề mặt thạch nghiêng. Hơ đầu ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.

- Tiếp tục gỡ nút bông ống nghiệm chứa môi trường, hơ đầu ống

nghiệm và nút bông, đưa que cấy chứa khuẩn lạc nấm men gần sát

xuống đáy ống thạch nghiêng, rê nhẹ đầu que cấy vẽ đường zigzag

hoặc những đường thẳng song song trên bề mặt thạch từ dưới đáy

dần dần trở ra miệng ống. Hơ đầu ống nghiệm và nút bông rồi đậy

lại.

- Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiêt diệt các vi sinh vật còn

lại trên que cấy.

- Đưa ống nghiệm chứa môi trường vào tủ ấm để nuôi cấy ở nhiệt độ

32°C trong 2-3 ngày.

-



141.

142.

3

-



-



Hình 7-24 Các hình thức cấy thạch nghiêng.



Phân lập bằng phương pháp cấy ria

Hóa lỏng ống nghiệm ½ chứa mơi trường Hansen đặc trong bể điều

nhiệt ở 100°C, đổ vào đĩa petri vô trùng, xoay nhẹ để môi trường trải

đều khắp đĩa, đậy nắp để mơi trường đơng lại hồn tồn.

Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng, để nguội.

Tháo nút bông ống chứa mẫu nấm men thuần, hơ lửa đầu ống và nút

bông. Đưa que cấy vào lấy 1 vòng mẫu nấm men. Hơ lại đầu ống

nghiệm và nút bông rồi đậy lại.

44



Hơ đầu đĩa petri, mở nắp, rê que cấy thành những đường zigzag từ

rìa hộp đến giữa hộp. Đóng nắp, hơ nhẹ trên lửa đèn cồn, xoay đĩa

một góc 90°.

- Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Hơ đầu đĩa petri, mở

nắp, rê que cấy bắt đầu từ vùng đã vẽ trước đó thành những đường

zigzag từ rìa đến nửa hộp. Đóng nắp, hơ nhẹ trên lửa đèn cồn, xoay

đĩa một góc 90° cùng chiều với lần xoay trước.

- Thực hiện một lần nữa những thao tác trên. Lưu ý tránh rê vào vùng

đã vẽ lần 1. Sau đó để yên vài phút cho mẫu cố định rồi lật úp đĩa

petri, bao gói giấy lại rồi cho vào tủ ấm nuôi cấy ở 30-33°C trong

khoảng 2-3 ngày.

4 KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

1

Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp đổ đĩa

2

Cấy chuyền vi sinh vật

a. Trong ống nghiệm thạch nghiêng (lỏng – rắn):

143.

Ống nghiệm không bị nhiễm, nấm men phát triển tạo nên vệt

nổi trên mặt thạch nghiêng, có màu trắng đục. Tuy nhiên, các vệt trên

mặt thạch chưa được đều và đẹp, do khi tiến hành cấy còn run, vạch

lên các đường không được đều.

144.

Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, phải ria cấy

ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên vì:

- Nếu ria từ trên xuống sẽ khó thao tác và làm rách thạch

- Ria từ dưới lên, que cấy sẽ theo chiều từ dưới đi lên và ra khỏi ống

nghiệm mà không cần di chuyển qua đường đã cấy, như vậy tránh

được tình trạng vi sinh vật mọc lan ra khỏi đường cấy.

- Khi môi trường được chuẩn bị xong sẽ có 1 giọt nước ở đáy ống

nghiệm, khi thao tác thường dùng que cấy hòa vào giọt nước và bắt

đầu ria, như vậy vi sinh vật sẽ mọc đều ở đường cấy.

-



-



145.



Hình 7-25 Ống nghiệm cấy ria (rắn – lỏng)



b. Trong ống nghiệm lỏng (lỏng – lỏng):

45



Ống nghiệm không bị nhiễm, nấm men phát triển tạo nên lớp

cặn có màu trắng đục dưới đáy ống nghiệm

146.



147.



148.



Hình 7-26 Ống nghiệm cấy chuyền (lỏng – lỏng)



149.

c. Trong hộp petri

150.

Hộp petri nuôi cấy vi sinh vật không bị nhiễm, tuy nhiên không



xuất hiện các khuẩn lạc màu đục mà chỉ có vết hằn ở đường cấy. Lí do

gây ra ở đây có thể do chất lượng con giống hoặc thao tác lấy mẫu lúc

que cấy còn nóng làm chết nấm men. Tuy nhiên vì cả 3 hộp petri đều bị

tình trạng tương tự nhau cho nên giống nấm men lỏng sử dụng ở đây bị

yếu khiến cho nấm men không phát triển khuẩn lạc rõ rệt.

151.

Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp mặt thạch vì:

- Tránh đổ vỡ khi sử dụng đĩa sau này

- Khi đặt úp mặt thạch sẽ tránh được tình trạng nhiễm những vi sinh vật

không mong muốn. Thông thường, sau khi cấy vi sinh vật, đĩa petri

được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng hoặc tủ ấm, điều này sẽ

sinh ra hơi nước. Nếu đặt ngửa mặt thạch, hơi nước bốc lên gặp nắp

đĩa petri sẽ rơi xuống trở lại môi trường, điều này làm ảnh hưởng đến

kết quả cấy, những vi sinh vật sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy hoặc bị

nhiễm.



46



153.

5



152.

Hình 7-27 Phân lập vi sinh vật trong hộp petri



NHẬT KÍ THÍ NGHIỆM

154.

Ngày 23/10/2018

155.

156.

Chuẩn bị lại mơi trường bị nhiễm

12h

157.

158.

Cô Ái vào lớp

13h

159.

160.

Cho môi trường đã chuẩn bị vào hấp tiệt trùng

13h3

0

161.

162.

Cô Ái hướng dẫn các kỹ thuật gieo cấy lỏng –

16h

lỏng, cấy thạch nghiêng, phân lập (cấy ria), định

lượng (trộn)

163.

164.

Tiến hành thí nghiệm

17h

165.

166.

Kết thúc thí nghiệm, ra về

18h3

0



47



8.BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HĨA

CARBOHYDRATE

1.



MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

- Quan sát, nhận xét đánh giá khả năng dị hóa Carbonhydrate của một

số lồi vi sinh vật trong mơi trường yếm khí và hiếu khí.

- Xác định vi sinh vật đó dị hóa Carbonhydrate theo con đường hơ hấp

hay lên men.

- Xác định khả năng thủy phân tinh bột thơng qua việc đo vòng tròn

thủy phân.

- Biết cách pha chế một số môi trường dinh dưỡng để chuẩn bị cho q

trình ni cấy.



2.



LÝ THUYẾT

2.1. Carbohydrate

- Carbohydrate là nguồn cung cấp carbon và năng lượng chủ yếu cho

phần lớn vi sinh vật.

- Carbohydrate có thể được phân loại thành đường đơn, đường oligo và

đường đa phân tử. - Tinh bột và cellulose là những loại đường đa phân

tử.

- Không phải mọi vi sinh vật đều có khả năng sử dụng đường đa phân

tử. Chỉ những vi sinh vật nào có khả năng tiết ra môi trường enzyme

ngoại bào để thủy phân những đường này thành đường đơn mới có

khả năng dị hóa chúng.

2.2. Khái niệm dị hóa

- Dị hóa là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ được tổng hợp trong

q trình đồng hóa tạo thành những hợp chất đơn giản và giải phóng

năng lượng.

- Khơng có dị hóa thì khơng có năng lượng để cung cấp cho q trình

đồng hóa và các hoạt động của tế bào.

2.3. Lên men và hô hấp

- Đường đơn khi được vận chuyển vào trong tế bào vi sinh vật có thể

được chuyển hóa theo 2 con đường để cung cấp năng lượng cho tế

bào. Đó là sự lên men và hơ hấp.

- Sự lên men thường không cần tới oxy, sản phẩm cuối tạo thành

thường là các loại acid hữu cơ.

- Hơ hấp hiếu khí bắt buộc phải có sự tham gia của oxy. Hơ hấp cho sản

phẩm cuối là khí carbonic và nước.

2.4. Môi trường OF

- Để xác định vi sinh vật sử dụng q trình lên men hay hơ hấp để phân

hủy đường, người ta thường sử dụng môi trường OF.

- Mơi trường OF có chứa hàm lượng đường cao và hàm lượng peptone

rất thấp. Peptone sẽ tạo điều kiện cho những vi sinh vật khơng có khả

năng hơ hấp hoặc lên men phát triển.

48



- Mơi trường OF có chứa bromthymol blue, là chất chỉ thị màu, sẽ có



màu vàng trong môi trường acid và màu xanh trong môi trường kiềm:

- Nếu vi sinh vật có khả năng lên men, mơi trường OF sẽ có màu vàng

trong cả 2 ống nghiệm.

- Nếu vi sinh vật chỉ có khả năng hơ hấp nhưng khơng lên men, chỉ có

ống nghiệm để trong điều kiện hiếu khí cho màu vàng.

- Nếu vi sinh vật khơng có khả năng lên men và hơ hấp, hai ống sẽ có

màu xanh.

3. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

3.1. Nguyên liệu và môi trường

- Vi khuẩn: Bacillus substilis, Lactobacillus acidophillus

- Nấm men: Sacharomyces cerevisiae

- Nấm sợi: Aspergillus oryzae

- Môi trường tinh bột (M8)

- Môi trường OF (M9)

- Dung dịch lugol (S3)

3.2. Chuẩn bị môi trường

a. Môi trường tinh bột M8

167.

Thành phần:

168.

gam/litre

169.

Bột chiết thịt bò

170.

3,00

171.

Tinh bột hòa tan

172.

10,00

173.

Thạch

174.

12,00

175.

Nước cất vừa đủ

176.

1 Liters

177.

Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút

b. Môi trường OF

178.

Thành phần:

179.

gam/litre

180.

Glucose

181.

10,00

182.

Peptone

183.

2,00

184.

NaCl

185.

5,00

186.

KH2PO4

187.

0,30

188.

Dd bromthymol blue

189.

3ml (dung môi là nước)

1%

190.

Agar

191.

3,00

192.

Nước cất vừa đủ

193.

1 Liters

3.3. Khả năng thủy phân tinh bột:

- Chuẩn bị hộp petri có chứa mơi trường tinh bột

- Cấy một điểm nhỏ bảo tử nấm mốc vào giữa hộp

- Ni cấy ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày

- Ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên

bề mặt hộp petri, phần nào tinh bột bị thủy phân môi trưởng sẽ trong

suốt. Phần khơng bị thủy phân sẽ có màu xanh

3.4. Môi trường OF-glucose:

- Cấy vi khuẩn, nấm men, nấm mốc vào từng cặp ống nghiệm có chứa

mơi trường OF-glucose

- Đổ dầu paraffin vào một ống nghiệm trong từng cặp

49



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

BÀI 7: GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×