Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Bài 6: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

Bài 6: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

Tải bản đầy đủ - 0trang

mẫn cảm với nhiệt độ. Việc cấy cấy dịch pha loãng trên bề mặt rồi dàn

đều bằng que gạt thủy tinh thường cho kết quả cao hơn về số lượng vi

sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đơng.



65.



66. Hình 6-18 Hình ảnh về đơn vị khuẩn lạc

3. CÁCH TIẾN HÀNH

3.1. Chuẩn bị môi trường:

67. Môi trường sử dụng: Plate Count Aga (PCA)

68. Thành phần:



69. gam/litre

71. 5,00

73. 2,50

75. 1,00

77. 15,00



Casein enzymic hydrolysate

Yeast extract

Dextrose

Agar

pH (tại 250C): 7,0 ± 0,2

Môi trường được đun sôi cho tan agar, phân phối vào bình tam giác

và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó để nguội về 40 – 45oC

rồi phân phối vào các đĩa petri vô khuẩn.

3.2. Lấy mẫu: quy trình lấy mẫu có những u cầu sau:

-Lấy mẫu có tính chất đại diện, lấy đủ.

-Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu vô khuẩn.

-Mẫu lấy xong phải làm ngay, khơng nên để lâu.

-Mẫu lấy phải ghi kí hiệu để phân biệt.

3.3. Pha loãng mẫu:

- Pha loãng mẫu theo nồng độ pha loãng khác nhau: 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4,

10-5, … theo sơ đồ sau:

70.

72.

74.

76.

78.

79.



35



80.



81. Hình 6-19 Trình tự pha loãng mẫu

3.4. Các phương pháp định lượng:

a. Phương pháp dàn đều trên petri (Phương pháp trang):

82. Nguyên lý:

- Một lượng nhỏ vi sinh vật được pha loãng được pha loãng trước được



dàn đều lên trên bề mặt hộp petri có chứa mơi trường dinh dưỡng

thích hợp.

83. Cách tiến hành:

- Mơi trường PCA nóng chảy được đổ vào hộp petri vơ khuẩn và chờ cho

đặc lại.

- Lấy 0,1 mL hỗn hợp vi sinh vật được pha loãng với nồng độ khác nhau

bằng micropipet cho vào hộp petri đã chứa môi trường đã đông đặc

và sử dụng que trang vô khuẩn để dàn đều ra khắp bề mặt hộp.

84. Lưu ý việc tiến hành cho môi trường vào petri hay trong quá trình

cho hỗn hơp vi sinh vật và trang đều phải được tiến hành quanh ngọn

lửa đèn cồn và phải hơ phần nắp hộp lúc đóng, mở để tránh bị lây

nhiễm bởi vi sinh vật khác.

- Lật ngược hộp petri và cuốn lại bằng giấy rồi bỏ và tủ ấm trong 48h

- Quan sát khuẩn lạc đã mọc và đếm.

b. Phương pháp sử dụng petrifilm:

85. Nguyên lý:

- Một lượng nhỏ vi sinh vật được pha loãng trước được hút cho vào

petrifilm và được cho vào tủ ấm để mọc khuẩn lạc.

86. Cách tiến hành:

- Đặt petrifilm cố định trên một mặt phẳng và kéo tấm film lên.

- Dùng micropipet nhỏ 1ml mẫu xuống đĩa, cố định mẫu ở giữa đĩa.

- Cuộn tấm film bên trên xuống thật cẩn thận để không tạo bọt khí.

Khơng để tấm film rơi xuống.

- Dùng dụng cụ có hình tròn lõm vào ở phía dưới, đặt miếng dàn trải

mẫu trên tấm màng trong vùng cấy.

36



- Dùng một lực nhẹ ấn lên miếng dàn trải mẫu đều lên vùng cấy trước



khi lớp gel hình thành. Xoay dụng cụ dàn trải mẫu để tạo vùng mẫu

có hình tròn.

- Lấy dụng cụ dàn trải mẫu ra, để cho lớp keo đông lại.

- Cho vào tủ ấm rồi chờ 48 giờ sau lấy ra đếm khuẩn lạc đã mọc.

- 2 ngày sau lấy ra đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc mọc có màu đỏ nên dễ

đếm.

4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

4.1. Phương pháp trang:



87.



88. Hình 6-20 Khuẩn lạc nấm men ở phương pháp trang

4.2. Phương pháp sử dụng petri film

89. Cách tính kết quả: chọn tất cả những hộp petri có khuẩn lạc dao



động từ 25-250 để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri

hay pertrifilm phải tuân thủ theo 1 quy luật hợp lí: độ pha lỗng càng

cao thì số khuẩn lạc đếm trên hộp hay petrifilm phải càng ít. Nếu kết

quả khơng hợp lí phải làm lại thí nghiệm.

• Với mẫu pha lỗng 10-4



37



90.



91. Hình 6-21 Khuẩn lạc mọc ở nồng độ pha

- Số khuẩn lạc đếm được: 214

- Ta tính được số khuẩn lạc ban đầu là:



92.

• Với mẫu pha lỗng 10-5



93.



94. Hình 6-22 Khuẩn lạc mọc ở nồng độ 10-4

-



Số khuẩn lạc đếm được lần lượt là: 54 và 70, có thể sử dụng để tính

tốn

38



-



Cơng thức tính: khi ở một nồng độ pha lỗng với 2 đĩa petri thì có số

khuẩn lạc dao động từ 25 – 250, còn lại đều nằm ngồi khoảng này.



95.

96. Trong đó:

97. N: số khuẩn lạc có trong 1 mL mẫu huyền phù ban đầu

98. C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa petrifilm với nồng độ đã



chọn

99. d: hệ số pha lỗng

- Từ cơng thức trên, thay kết quả vào ta được số khuẩn lạc ban đầu là:

100.

 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chệnh lệch lớn hơn 2

lần: sử dụng độ pha lỗng nhỏ hơn để tính kết quả

- Ở độ pha lỗng , số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu là:

- Ở độ pha loãng , số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu là:

- Vì chệnh lệch giữa và lớn hơn 2 lần nên ta sẽ sử dụng độ pha loãng

nhỏ hơn ( để tính kết quả. Số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu

sẽ là

5. NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM

101.

102.



13h3

0

104.



14h

106.



15h3

0

109.



16h

111.



16h4

0

113.



Ngày 16/10/2018

103.

Cơ Ái hướng dẫn các thao tác thực hiện thí

nghiệm trải và sử dụng petri film

Cho các môi trường đã chuẩn bị bị nhiễm mốc

vào nồi hấp tiệt trùng

107.

Rửa các ống nghiệm chứa mơi trường bị nhiễm

108.

Pha lỗng canh trường ra các nồng độ 1/10,

1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000

110.

Cho môi trường từ ống nghiệm vào hộp petri

sau khi đã làm tan thạch bằng bể điều nhiệt

112.

Cho 1mL canh trường vi sinh vật lên petri film

và để vào tủ ấm

105.



114.



Kết thúc thí nghiệm và ra về



17h3

0



39



7.BÀI 7: GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM

- Nắm được các bước của quá trình phân lập vi sinh vật và các thao tác

cấy chuyền trong nuôi cấy vi sinh vật.

- Rèn luyện kỹ năng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật.

- Hiểu và nắm vững hơn ý nghĩa của việc phân lập, nuôi cấy và bảo

quản vi sinh vật.

2 LÝ THUYẾT

115.

Mục đích của gieo cấy: để ni cấy vi sinh vật, cần phải thường

xuyên cấy vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác và đảm

bảo trong khi cấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật đang sử dụng với

những vi sinh vật không mong muốn từ môi trường xung quanh.

1

Ni cấy vi sinh vật

116.

Q trình ni cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: nuôi và cấy. Hai

khâu này gắn bó với nhau trong q trình nghiên cứu và ứng dụng vi

sinh vật.

- Ni: là q trình đẩm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất

cho hoạt động và phát triển của vi sinh vật.

- Cấy: là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống

sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.

a. Mục đích:

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm

cần nghiên cứu.

- Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng.

- Bảo tồn các giống thuần khiết.

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của chúng.

b. Nguyên tắc:

- Mọi thao tác nuôi cấy phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để

tránh nhiễm khuẩn.

- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng.

- Duy trì các điều kiện thuận lợi để vi sinh vật phát triển

c. Các kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật

2

Phân lập vi sinh vật

117.

Trong thiên nhiên hay trong các vật phẩm nghiên cứu, VSV

thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên

cứu về hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng vào thực tiễn một lồi

nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.

118.

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể

ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. VSV dạng thuần khiết là giống

VSV được tạo ra từ một tế bào ban đầu.

119.

Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên

cứu và ứng dụng VSV

a. Nguyên tắc:

- Tách rời các tế bào vi sinh vật.

1



40



Nuôi cấy các tế bào trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc

riêng rẽ.

120.

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các

bước:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập các vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của vi sinh vật

121.

b. Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:

- Phương pháp đồ đĩa

- Phương pháp dàn đều

- Phương pháp cấy ria

3

Các phương pháp giữ giống vi sinh vật

a. Nguyên tắc:

- Các chủng vi sinh vật thuần khiết sau khi phân lập được cần được

phải bảo quản ở điều kiện tối ưu sao cho sau thời gian bảo quản

chúng vẫn ở trạng thái hoạt động và giữ được hoạt tính khơng bị thay

đổi.

- Đảm bảo tốt các điều kiện trong q trình bảo quản để khơng làm

thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.

- Làm chậm quá trình trao đổi chất và hô hấp ở vi sinh vật đồng thời

ngăn cản quá trình sinh sản của chúng.

b. Các phương pháp:

122.

Các phương pháp cấy chuyền:

Cấy chuyền định kỳ:

123.

- Phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh

vật. Với nấm men, vi khuẩn cấy chuyền sau 1-2 tháng, với nấm mốc cấy

chuyền sau 3-6 tháng. Thời gian giữa 2 lần cấy có thể kéo dài hơn nếu

sau khi cấy vi sinh vật bảo quản ở nhiệt độ thấp (3-5ºC).

124.

Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm.

125.

Nhược điểm: tốn môi trường, công sức, thời gian, thời gian bảo

quản khơng lâu.

126.

- Tính chất ban đầu của giống có thể bị thay đổi do nhiều

nguyên nhân khó xác định cụ thể trong quá trình cấy chuyền.

127.

- Bảo quản dưới dầu: paraffin phủ trên lớp thạch nghiêng sẽ

giúp ngăn cản sự bay hơi nước của môi trường nuôi cấy vi sinh vật và

làm chậm tốc độ phát triển của vi sinh vật nhờ hạn chế O2.

128.

- Bảo quản trong nước: Cắt một khối agar 6mm từ rìa khuẩn

lạc. Đặt khối agar đó vào trong ống nghiệm có chứa nước cất vô khuẩn,

đậy chặt nắp ống nghiệm và bảo quản ở 25ºC

Phương pháp đông khô:

129.

- Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do.

Đồng thời làm giảm, thậm chí ngừng hẳn q trình phân chia của vi

sinh vật. Nhờ đó chúng chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh

-



41



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Bài 6: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×