Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Bactéries indicatrices de contamination et d'efficacité de traitement

Bactéries indicatrices de contamination et d'efficacité de traitement

Tải bản đầy đủ - 0trang

4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.1 Dénombrement des germes totaux

par épifluorescence



■ Principe



La méthode comprend une fixation permettant la conservation, une coloration avec un composé fluorescent, une filtration sous vide sur une membrane en polycarbonate non fluorescente et une numération avec un

microscope à épifluorescence.

■ Matériel spécial

– Microscope avec éclairage UV vertical pour épifluorescence avec un objectif à immersion 100 x pour obtenir un grossissement final d’au moins 1 000 x.

– Mixer ou agitateur à vortex.

– Unité de filtration adaptée à l’utilisation de membranes filtrantes de 25 mm de diamètre.

– Membrane filtrante en polycarbonate de 25 mm de diamètre, d’une dimension de pores

de 0,45 μm achetée noire (ou préparée par trempage de la membrane dans le noir Irgalan :

2 g/L dans une solution d’acide acétique à 2 %) puis rincée dans l’eau et séchée à l’air

sec.

– Membrane cellulosique de 25 mm de diamètre, dimension de pores 5 mm.

– Seringues de 3 mL équipées de filtres de pores de 0,2 μm.

– Tubes en verre à bouchon fileté de 13 × 125 mm.



■ Réactifs

– Solution tampon phosphate pH 7,2 :

dihydrogénophosphate de potassium

eau déionisée



13,6 g

q.s.p.



1 000 mL



Ajuster le pH à 7,2 si nécessaire. Filtrer la solution à travers une membrane filtrante de

0,2 μm.

– Fixateur :

glutaraldéhyde

solution tampon



0,5 g

q.s.p.



100 mL



À préparer chaque jour.

– Solution fluorescente :

orangé d’acridine

solution tampon phosphate



0,1 g

q.s.p.



100 mL



– Solution Triton x – 100 (à 0,1 %) :

Triton x – 100



1 mL



saccharose (0,2 M )



68,42 g



EDTA solution à 0,1 %



1 mL



acide citrique (0,02 M )



3,84 g



dihydrogénophosphate de potassium (0,02 M )

eau déionisée stérile



2,72 g

q.s.p.



1 000 mL



Filtrer.

– Huile d’immersion faiblement fluorescente.



■ Mode opératoire



Prélever l’échantillon d’eau selon la méthodologie habituelle. Introduire

9 mL d’échantillon dans un tube contenant 1 mL de fixateur. Les échantillons fixés pourront être conservés à 4 °C pendant 3 semaines sans diminution significative du nombre de germes. Bien homogénéiser. Filtrer l’eau

748



4.2 Dénombrement des bactéries aérobies

revivifiables



traitée sur membrane noire, rincer 30 s avec agitation de va-et-vient dans

20 mL de solution tampon phosphate. Sécher les membranes dans un

courant d’air chaud puis les immerger dans la solution de triton x – 100 à

0,1 % filtrée. Rincer avec la solution tampon phosphate puis immerger les

membranes dans 20 mL de solution filtrộe dorangộ dacridine. Pratiquer un

troisiốme rinỗage dans la solution tampon phosphate, filtrer sous vide (environ 13 kPa). Rincer avec 2 mL de solution tampon et filtrer. Retirer le filtre

en polycarbonate avec des pinces et sécher à l’air sec 1 ou 2 min. Couper

le filtre en 4 morceaux et conserver si nécessaire. Monter le filtre sec dans

une goutte d’huile à immersion sur une lame. Ajouter une goutte d’huile à

immersion à la surface du filtre. Couvrir délicatement le filtre avec une

lamelle. Les échantillons peuvent être conservés dans le noir plusieurs

mois sans perte significative de la fluorescence.

Examiner au moins 20 champs du filtre avec l’objectif à immersion, grossissement 100 x pour vérifier que la distribution des bactéries est uniforme et

que les germes peuvent bien être dénombrés individuellement (sinon,

diluer l’échantillon et recommencer). Compter de préférence 10 à 50 germes par champ.

■ Expression des résultats



Calculer le nombre de germes moyens par filtre. Obtenir la surface réelle

du filtre à partir des spécifications du fabricant.

Déterminer le nombre de germes par millilitres d’échantillon par extrapolation.

Nombre

de germes =

totaux par mL



΂



΃΂



Nombre moyen

×

de germes

par carré



Nombre de carrés Facteur

du filtre

de dilution

–––––––––––––––––––––––––

Volume d’échantillon (en mL)



΃



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.2 Dénombrement des bactéries aérobies

revivifiables (germes aérobies mésophiles,

hétérotrophes)

Cet examen vise à dénombrer non spécifiquement le plus grand nombre de

micro-organismes, en particulier de bactéries se développant dans les

conditions aérobies habituelles de culture. Quel que soit le milieu utilisé, le

développement de l’ensemble des bactéries présentes n’est jamais obtenu :

certaines espèces demandent des apports nutritifs et des conditions de

milieu qui sont défavorables à la prolifération d’autres espèces. Cela veut

dire que deux résultats ne sont comparables que s’ils proviennent d’analyses pratiquées selon la même méthodologie et avec les mêmes milieux de

culture.

Le dénombrement des germes aérobies mésophiles est utilisé comme indicateur de pollution :

– Soit dans les milieux naturels, le plus souvent dans les eaux de très

bonne qualité microbiologique dont on veut éprouver la protection vis-à-vis

749



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.2 Dénombrement des bactéries aérobies

revivifiables



de toute contamination ; ce sont donc essentiellement les eaux souterraines, de nappes profondes ou alluviales, qui sont soumises à cet examen,

mais aussi les eaux de surface comme celles de certains lacs loin des

rives.

– Soit dans les réseaux : une augmentation de la concentration bactérienne en aval de la station de pompage ou de traitement doit être interprétée soit comme une multiplication interne de bactéries existant à l’entrée du

réseau, soit comme une intrusion de l’extérieur dans celui-ci, au niveau des

réservoirs ou des canalisations.

Le même dénombrement est également utilisé comme indicateur d’efficacité de traitement, en particulier des traitements physiques tels que la filtration, qui devrait entrner soit une très forte diminution de la concentration

bactérienne par rapport à l’entrée, soit même une absence de bactéries.

Ce dénombrement peut donner en outre des indications importantes pour

juger la validité de techniques utilisées pour la recherche d’autres paramètres : un nombre très élevé de germes par rapport à un nombre très faible

de coliformes rend le dénombrement de ces derniers très incertain par leur

comptage sur membrane filtrante.

Les dénombrements sont effectués après incubation soit à 36 °C, en

48 heures, soit à 22 °C en 72 heures. Traditionnellement, le dénombrement

à 37 °C est estimé plus péjoratif du point de vue signification sanitaire que

celui à 20 °C ; cette distinction est assez fréquemment contreversée actuellement. Cependant pour effectuer un inventaire global de la population

bactérienne dans les milieux naturels, l’incubation à 20 °C devrait être préférée.

Il est usuel d’exprimer les résultats de dénombrements bactériens en nombre de bactéries (ou plus généralement de micro-organismes) par mL se

développant dans les conditions expérimentales choisies (*).



4.2.1 Méthode par incorporation en milieu gélosé

■ Principe



L’eau est inoculée par incorporation dans un milieu strictement défini et non

sélectif. La lecture est faite après 48 heures d’incubation à 36 °C ou après

72 heures d’incubation à 22 °C. Cette méthode fait cependant subir un choc

thermique aux micro-organismes au moment de l’incorporation de la gélose

en surfusion (à 45 °C).

■ Domaine d’application



Cette méthode est la plus employée pour les analyses à but sanitaire. Avec

le mode opératoire type, elle donne des résultats de précision correcte pour

les échantillons contenant plus de 30 germes par mL. Cette méthode est

donc utilisable pour l’application de la réglementation concernant les eaux

d’alimentation délivrées sous forme conditionnée.

(*) De plus en plus actuellement, on remplace cette expression « nombre de germes » par celle de « nombre

d’unités formant colonie » (en abréviation UFC). Cette dernière expression tient compte du fait qu’une seule

colonie visible, et comptée, peut provenir en réalité d’un germe ou de plusieurs germes agglutinés.



750



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.2 Dénombrement des bactéries ắrobies

revivifiables



■ Diluants

Utiliser pour les dilutions éventuelles l’un des diluants suivants :

– Solution de Ringer diluée au 1/4.

Préparer la solution suivante :

9 mL



chlorure de potassium



0,42 g



chlorure de calcium



0,48 g



hydrogénocarbonate de sodium

eau déionisée



0,2 g

q.s.p.



1 000 mL



Diluer au quart cette solution à l’aide d’eau permutée. Répartir en flacons. Stériliser

20 minutes à l’autoclave à 121 Ȁ 1 °C.

– Eau permutée stérile.



■ Milieux de culture

– Gélose à l’extrait de levure :

tryptone



6g



extrait de levure déshydraté



3g



agar

eau déionisée



15 g

q.s.p.



1 000 mL



Dissoudre dans l’eau à l’ébullition, les composants. Si nécessaire, ajuster le pH de sorte

qu’après stérilisation il soit de 7,0 Ȁ 0,2 à 20 °C (mesure effectuée à 44 °C Ȁ 2 °C avec

correction de température). Répartir le milieu en tubes (par exemple de 18 × 180 mm) à

raison de 15 mL par tube. Stériliser à l’autoclave à 121 °C Ȁ 1 °C pendant 20 minutes.

Le développement des diverses espèces bactériennes dépendant de la composition du

milieu, il est indispensable, afin que les résultats soient reproductibles, que celle-ci soit

constante et que le taux d’humidité du milieu soit également constant. Ce milieu doit donc

ờtre conservộ dans des flacons ou tubes fermộs dune faỗon étanche, pour éviter toute

évaporation, et ne pas être préparé depuis plus d’un mois au moment de l’emploi.



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



chlorure de sodium



– Plate count agar (gélose pour dénombrement) :

tryptone



5g



extrait de levure



2,5 g



glucose



1g



agar

eau déionisée



15 g

q.s.p.



1 000 mL



Préparer ce milieu comme le milieu prộcộdent. Assurer sa conservation de la mờme

faỗon.

Ce milieu existe commercialement sous forme déshydratée.



■ Mode opératoire



Préparation des dilutions et répartition pour l’ensemencement

Pour les eaux embouteillées, ensemencer en duplicata (deux btes de

Pétri).

Lorsque seuls des ensemencements avec 1 mL d’eau non diluée sont

pratiquer, agiter soigneusement et de faỗon prolongộe lộchantillon pour

remettre en suspension dune faỗon homogốne les bactộries. Prộlever

ensuite stộrilement 1 mL de cette eau ; le déposer dans une bte de Pétri

stérile de 90 mm de diamètre.

751



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.2 Dénombrement des bactéries aérobies

revivifiables



Si la lecture doit porter sur de l’eau diluée, introduire dans une série de tubes

stériles correspondant au nombre de dilutions à utiliser, 9 mL d’eau stérile ou

de solution de Ringer diluée au 1/4. Prélever ensuite 3 fois 1 mL d’échantillon

soigneusement agité, et déposer deux des prélèvements dans une bte de

Pétri stérile, et le troisième dans le premier des tubes contenant 9 mL.

Agiter soigneusement le tube de dilution au 1/10 ainsi préparé à l’aide d’un

agitateur mécanique. Prélever à l’aide d’une nouvelle pipette stérile 3 fois

1 mL, et les déposer, d’une part dans le deuxième tube (réalisant ainsi la

dilution au 1/100), d’autre part dans deux autres btes de Pétri. Continuer

ainsi jusqu’à ce que toutes les dilutions nécessaires aient été effectuées.

Incorporation à la gélose, incubation

Porter au bain-marie bouillant les tubes contenant la gélose jusqu’à fusion

du milieu. Refroidir à 44 °C Ȁ 2 °C et maintenir au bain-marie à cette température. Couler aseptiquement dans chaque bte le contenu d’un tube de

gélose fondue, maintenue à 44 °C Ȁ 2 °C ; agiter doucement par un mouvement circulaire pour assurer un mélange homogène de l’eau et de la

gélose, sans faire de bulles et sans mouiller les bords de la bte. Le milieu

doit être coulé 10 minutes au plus tard après répartition de l’eau à analyser.

Laisser refroidir sur une surface parfaitement horizontale et frche.

La moitié des btes ensemencées avec chacune des différentes dilutions

d’eau est incubée, aussitôt après solidification, dans une étuve à 36 °C Ȁ 2 °C

durant 44 (Ȁ 4) heures. L’autre est placée dans une enceinte maintenue à

une température de 22 °C Ȁ 2 °C durant 68 (Ȁ 4) heures. Conserver les

btes à l’obscurité, couvercle en dessous.

Lecture

Examiner les btes dès que possible après la période d’incubation, sinon

les conserver à 5 °C Ȁ 3 °C pendant 48 heures au maximum. Compter les

colonies, en s’aidant au besoin d’une loupe de grossissement 1,5 ou d’une

loupe binoculaire.

■ Expression des résultats



Les résultats sont exprimés en nombre de micro-organismes revivifiables

par mL, dans les conditions de l’essai, chaque colonie étant par convention

considérée comme ayant été engendrée par un seul micro-organisme.

Exprimer les résultats en UFC. Pour les eaux embouteillées, les résultats

sont calculés par la moyenne des deux btes de la même série de dilution

(incubées soit à 36 °C, soit à 22°C).



Remarque

Le terme « tryptone » n’étant actuellement utilisé que par certains producteurs

de milieux, tout autre digestat de caséine donnant des résultats comparables

peut être utilisé.



Méthode de référence

Norme AFNOR NF EN ISO 6222 (juillet 1999). Qualité de l’eau –

Dénombrement des micro-organismes revivifiables – Comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé.



752



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.2 Dénombrement des bactéries aérobies

revivifiables



4.2.2 Méthode par ensemencement en surface sur milieu gélosé

■ Principe



la prise d’essai est déposée à la surface d’une bte de gélose, où elle est

soigneusement répartie à l’aide d’un étaleur. Elle est ensuite incubée dans

les mêmes conditions que dans la méthode par incorporation.

■ Domaine d’application



■ Milieux de culture

Utiliser les mêmes milieux que ceux proposés pour la méthode de dénombrement par

incorporation (E.4.2.1 : gélose à l’extrait de levure, Plate count agar ), et si besoin les

mêmes liquides de dilution.



■ Mode opératoire



Les btes de gélose doivent être préparées (coulées, solidifiées, refroidies,

convenablement séchées) avant le début des manipulations. Agiter très

soigneusement l’échantillon à analyser. Prélever une prise d’essai de

0,1 mL avec une pipette graduée et la disposer à la surface du milieu à

l’aide d’un étaleur stérile. Répartir uniformément la goutte sur toute la surface de la boợte. Ensemencer de cette faỗon pour chaque tempộrature

dincubation une bte, ou de préférence plusieurs, pour obtenir une plus

grande précision dans le rộsultat. Si leau est soupỗonnộe contenir plus de

3 000 germes par mL, pratiquer des dilutions selon les indications données

pour la méthode par incorporation en gélose, et les ensemencer selon ces

mờmes indications en remplaỗant le volume indiquộ de 1 mL, par celui de

0,1 mL. Incuber de la même manière, à 37 °C et 20 °C et procéder à la

lecture du nombre de colonies développées sur chaque bte.



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



Cette méthode est plus spécialement adaptée aux eaux contenant des

germes susceptibles d’être sensibles au choc thermique, par exemple les

eaux de surface (lacs de régions froides) ; elle est également intéressante

pour procéder à l’identification des colonies. Toutefois, elle n’est valablement applicable qu’aux eaux dont la concentration est supérieure à 200 ou

300 (à la rigueur 100) germes par mL.



■ Expression des résultats



Le nombre de colonies compté sur une bte, multiplié par 10 et éventuellement par l’inverse du rapport de dilution, indique le nombre de bactéries

aérobies mésophiles contenues dans 1 mL d’échantillon et revivifiables

dans les conditions d’expérience. Les résultats sont exprimés sous cette

forme : nombre de germes par mL, en précisant la température et la durée

d’incubation, ainsi que le milieu utilisé et la méthode suivie.



753



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.3 Dénombrement des coliformes



4.3 Dénombrement des coliformes

4.3.1 Classification des coliformes.

Intérêt et modalités de leur recherche

■ Définition des coliformes



Le terme de « coliformes » ne correspond pas à une définition microbiologique stricte. Sous ce terme est regroupé un certain nombre d’espèces bactériennes appartenant en fait à la famille des Enterobacteriaceae et qui

partagent certaines caractéristiques biochimiques.

La définition suivante a été adoptée par l’Organisation internationale de

standardisation (ISO). Le terme « coliforme » correspond à des organismes en

bâtonnets, non sporogènes, Gram négatifs, oxydase négatifs, facultativement anắrobies, capables de crtre en présence de sels biliaires ou d’autres

agents de surface possédant des activités inhibitrices de croissance similaires, et capables de fermenter le lactose (et le mannitol) avec production

d’acide et d’aldéhyde en 48 heures, à des températures de 35 à 37 °C.

Le dénombrement de ces organismes à 35-37 °C est souvent désigné sous

l’expression de « dénombrement des coliformes totaux ». Ainsi, les coliformes

constituent-ils un rassemblement assez hétéroclite du point de vue taxonomique. Mais leur étude est traditionnelle et les renseignements donnés par cet

examen sont d’une certaine utilité dans le domaine de la santé publique.

Les coliformes comprennent entre autres les genres : Escherichia,

Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Yersinia, Serratia.

À la définition précédente des coliformes, il convient d’ajouter les trois définitions suivantes :

– Le terme de « coliformes fécaux » ou de « coliformes thermo-tolérants »

correspond à des coliformes qui présentent les mêmes propriétés (caractéristiques des coliformes) après incubation à la température de 44 °C. Le

groupe des coliformes fécaux comprend entre autres les espèces suivantes : Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Citrobacter amalonaticus,

Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Moellerella wisconsensis, Salmonella,

Yersinia enterocolitica.

– Le terme « E. coli présumé » correspond à des coliformes thermotolérants qui produisent de l’indole à partir de tryptophane, à 44 °C.

– Le terme « E. coli » correspond à des coliformes thermotolérants qui produisent de l’indole à partir du tryptophane et ont les caractères biochimiques propres à cette espèce.

Aujourd’hui la réglementation parle de recherche de coliformes totaux. On

ne distingue pas les coliformes d’origine fécale des autres origines (telluriques, cliniques, etc.) et de E. coli (coliformes d’origine fécale).

■ Intérêt hygiénique de la recherche des coliformes dans une eau



Les coliformes sont intéressants car un très grand nombre d’entre eux

vivent en abondance dans les matières fécales des animaux à sang chaud

et de ce fait, constituent des indicateurs fécaux de la première importance.

Par ailleurs, leur résistance aux agents antiseptiques, et notamment au

754



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.3 Dénombrement des coliformes



chlore et à ses dérivés, est voisine de la résistance des bactéries pathogènes vis-à-vis desquelles ce type de traitement est instauré ; ils constituent

donc des indicateurs d’efficacité de traitement.

■ Examens bactériologiques usuels se rapportant aux coliformes



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



Au total, trois types d’examens colimétriques peuvent être distingués :

– La recherche et le dénombrement de l’ensemble des coliformes, sans

préjuger de leur appartenance taxonomique et de leur origine.

Cet examen, capital pour la vérification de l’efficacité d’un traitement désinfectant, est d’un intérêt plus nuancé pour déceler une contamination d’origine fécale.

– La recherche et le dénombrement des coliformes fécaux, examen sans

base taxonomique, mais proposé en raison d’une concordance statistique

entre leur présence et l’existence d’une contamination fécale quasi certaine.

– La recherche et le dénombrement des seuls Escherichia coli.

Ces deux derniers examens sont, au contraire, essentiels dans le diagnostic d’une contamination fécale.

Les analyses, les plus fréquemment pratiquées, répondent de fait aux exigences réglementaires concernant la surveillance courante de la qualité

microbiologique des eaux. Il y a peu de différence, du point de vue pratique,

entre les indications fournies par les dénombrements de coliformes fécaux

et de Escherichia coli présumés. L’examen est souvent orienté vers l’un ou

l’autre de ces dénombrements plutôt pour des raisons de techniques de

laboratoire que pour des impératifs hygiéniques.

Les méthodes décrites ci-après conduisent à mettre en évidence ou à

dénombrer des groupes de bactéries dộfinies dune faỗon empirique par

certains de leurs caractốres biologiques ou culturaux. Dans certains cas, il

peut être nécessaire de confirmer l’identification et de déterminer la position

taxonomique des espèces formant les colonies.

Il conviendra alors, soit à partir d’une colonie parfaitement isolée sur gélose

sélective, soit après réisolement du germe par isolement en stries sur

milieu gélosé ordinaire, de pratiquer une coloration de gram (bacilles à

Gram négatif), une oxydase (négative), l’ensemencement d’une galerie

d’identification biochimique miniaturisée à 20 caractères ou 32, voir une

identification moléculaire.

L’apparition dans une eau de bonne qualité habituelle de coliformes non

thermotolérants peut inciter à une identification de ces coliformes, l’espèce

pouvant parfois donner des renseignements sur l’origine des bactéries

(Raoultella est plus souvent d’origine environnementale que Klebsiella par

exemple). Il ne part pas nécessaire de recommander, en l’absence de

coliformes thermotolérants, d’identifier les coliformes non thermotolérants

présents dans une eau.

Enfin, le dénombrement direct des Escherichia coli dans l’échantillon peut

être utile ; il pourra être effectué selon la méthode par ensemencement en

milieu liquide (NPP) en microplaques.



755



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.3 Dénombrement des coliformes



4.3.2 Méthode de dénombrement par filtration sur membrane

■ Principe



Après filtration de l’eau à étudier, la membrane est déposée sur un milieu

gélosé approprié. Ceci permet aux colonies de coliformes de se développer

préférentiellement au cours d’une incubation de 18 à 24 heures, et sous un

aspect suffisamment caractéristique pour autoriser un diagnostic présomptif. Celui-ci peut d’ailleurs être confirmé par des repiquages judicieux.

■ Domaine d’application



Son domaine d’application privilégiée est les eaux claires ne contenant pas

de matières en suspension susceptibles de colmater : eaux d’alimentation,

de surface et de baignade claires.

■ Milieux de culture

Géloses lactosées

– Géloses lactosées au TTC et Tergitol (milieu de Chapmann, modifié par R. Buttiaux).

Solution A :

Dans 1 litre d’eau déionisée, dissoudre par chauffage :

extrait de viande

peptone

extrait de levure

lactose

bleu de bromothymol

agar



5g

10 g

6g

20 g

0,05 g

20 g



Ajuster le pH à 7,2. répartir (100 mL) dans des flacons de 150 mL. Stériliser 20 minutes

à l’autoclave à 120 °C.

Solution B :

Dissoudre 0,05 g de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) dans 100 mL d’eau

déionisée. Filtrer ou stériliser 20 minutes à l’autoclave à 120 °C.

Solution C :

Dissoudre 0,20 g de Tergitol 7 dans 100 mL d’eau déionisée.

Au moment de l’emploi, faire fondre la solution A (base gélosée) et maintenir à 45-50 °C.

Ajouter 5 mL de solution B et 5 mL de solution C. Bien mélanger en évitant les bulles.

Couler en btes de Pétri stériles de 60 mm. L’épaisseur du milieu doit être de 5 mm.

Laisser solidifier. Ce milieu se conserve 10 jours à 4 °C.

La base gélosée existe commercialement sous forme déshydratée ou prête à l’emploi, les

solutions B et C étant présentées en ampoules. Il existe également des tampons absorbants imprégnés de ce milieu (« milieu de culture sur carton Tergitol TTC »).

– Gélose lactosée au lauryl sulfate de sodium :

peptone

extrait de levure



6 g



lactose



30 g



rouge de phénol en solution aq. 0,4 %



50 mL



lauryl sulfate de sodium pur

agar

eau déionisée



756



40 g



1 g

15 g

q.s.p. 1 000 mL



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.3 Dénombrement des coliformes



Dissoudre par chauffage les ingrédients. Ajuster le pH de telle sorte qu’après stérilisation,

il soit de 7,4 à 7,5. Répartir en flacons de volume adapté à l’utilisation, par exemple de

100 mL. Autoclaver 15 minutes à 121 °C.

Pour l’utilisation faire fondre le milieu et le couler en bte de Pétri de 60 mm de diamètre.

La base de ce milieu existe déshydratée.

Milieux de confirmation

– Bouillon lactosé bilié au vert brillant.



Ce milieu existe commercialement sous forme déshydratée ou prêt à l’emploi.

– Eau peptonée.

Dissoudre 10 g de peptone et 5 g de chlorure de sodium dans 1 litre d’eau déionisée.

Amener le pH à 7,2. répartir (5 mL) dans des tubes de 160 × 16 mm. Stériliser 20 minutes

à l’autoclave à 120 °C.

Ce milieu ne doit pas contenir d’indole. S’en assurer par incubation d’un échantillon non

ensemencé. La réaction doit être négative. Elle doit être au contraire positive (présence

de tryptophane, nécessaire à la production d’indol) après inoculation avec une souche

indologène d’Escherichia coli.

Ce milieu existe commercialement prêt à l’emploi ou déshydraté. Certaines préparations

précisent : « eau peptonée exempte d’indol ».

– Milieu de Schubert modifié par Fennel.

Dissoudre dans 500 mL d’eau déionisée 0,2 g de tryptophane ; 0,2 g d’acide glutamique,

0,7 g de sulfate de magnésium ; 0,4 g de sulfate d’ammonium ; 0,5 g de citrate de sodium ;

2 g de chlorure de sodium ; 10 g de tryptone (Oxoïd ou marque équivalente) ; 7,5 g de

mannitol.



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



Dissoudre dans de l’eau déionisée 10 g de peptone et 10 g de lactose. Dissoudre séparément 20 g de bile déshydratée dans 200 mL d’eau permutée et ajuster le pH de cette

solution entre 7 et 7,5. Mélanger les deux solutions et compléter à 975 mL avec de l’eau

déionisée. Ajuster à pH 7,4. Ajouter 13,3 mL de solution de vert brillant à 0,1 % dans l’eau

déionisée. Filtrer sur coton. Répartir (10 mL) dans des tubes de 160 × 16 mm avec cloches de Durham. Stériliser 20 minutes à l’autoclave à 125 °C.



D’autre part, ajouter à 435 mL d’une solution 1/15 M de monohydrogénophosphate de

potassium anhydre (soit à 9,47 g/L) et 65 mL d’une solution 1/15 M de dihydrogénophosphate de potassium (soit à 9,073 g/L). S’assurer que le pH est bien à 7,6.

Mélanger les deux solutions précédentes. Répartir en tubes avec cloches de Durham à

raison de 5 mL par tube. Stériliser à l’autoclave 10 minutes à 115 °C.

Avant la répartition en tubes, il est possible d’ajouter au litre de milieu préparé, 10 mL

d’une solution de ricinoléate de sodium à 10 %.

– Bouillon au Lauryl Tryptose Mannitol (LTM) :

tryptose



20 g



mannitol



5 g



monohydrogénophosphate de potassium (K2HPO4)



2,75 g



dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)



2,75 g



chlorure de sodium (NaCl)

lauryl sulfate de sodium

eau déionisée



5 g

0,1 g

q.s.p. 1 000 mL



Le pH du milieu après stérilisation doit être de 6,8 environ.

Répartir en tubes avec cloches de Durham à raison de 10 mL de milieu par tube. Stériliser

à l’autoclave 10 minutes à 115 °C.



757



4 • Bactéries indicatrices

de contamination



4.3 Dénombrement des coliformes



Réactifs

– Réactifs d’Erlich-Kovacs pour recherche de l’indol.

Dissoudre 7 g de p-diméthyl aminobenzaldéhyde dans 75 mL d’alcool amylique en chauffant doucement au bain d’eau à environ 50 à 55 °C. Refroidir. Ajouter 20 mL d’acide

chlorhydrique. Conserver à l’abri de la lumière et à 4 °C environ.

S’utilise en ajoutant 0,5 mL environ à un tube à essai de milieu liquide où est supposé

s’être formé de l’indol. Une coloration rouge se développe dans la phase alcoolique lorsque la réaction est positive.

– Alcool isoamylique et acide nitrique pour recherche de l’indol.

Une coloration rouge peut être également obtenue en ajoutant au milieu de culture 1 mL

d’alcool amylique et 5 gouttes d’acide NO3H additionné de quelques cristaux de nitrite de

sodium.

– Réactif pour mettre en évidence l’oxydase.

Solution à 1 % de chlorhydrate de tétraméthylparaphénylènediamine à préparer extemporanément.

Dans le commerce, il existe des disques et bandelettes imprégnés de cette solution. Au

moment de l’emploi, les réhydrater avec un peu d’eau déionisée stérile.



■ Choix des prises d’essai



La plupart des réglementations et notamment les directives du Conseil

des communautés européennes concernant les eaux destinées à l’alimentation humaine exigent l’absence de coliformes ou de coliformes fécaux

dans 100 mL. Pour ce type d’eau, ce sera donc la prise d’essai usuelle.

Pour des eaux polluées, il faut souvent procéder à des dilutions, afin

de ne pas obtenir de développements de plus de 100 colonies sur la

membrane.

■ Mode opératoire



Première étape : dénombrement direct sur la membrane

Elle conduit à un dénombrement présomptif des coliformes et des coliformes fécaux.

Filtrer sur deux membranes différentes, dans les conditions précisées antérieurement, deux prises d’essai de l’eau à analyser soigneusement homogénéisée par agitation. Les prises d’essai ne devant pas être inférieures à

20 mL, diluer si nécessaire. Placer chacune des deux membranes sur une

bte de gélose lactosée au TTC et Tergitol. Mettre ces btes à incuber

durant 24 heures l’une à 37 °C, l’autre à 44 (Ȁ 0,5 °C). Très important :

l’enceinte à 44 °C doit avoir une température homogène et son atmosphère

être chargée de vapeur d’eau. Placer au fond de l’étuve une cuve large,

remplie d’eau en permanence.

La norme demande un complément d’incubation de 24 heures aux deux

températures. Ce temps d’incubation est nécessaire vis-à-vis des germes

stressés comme c’est le cas des germes en présence de chlore dans le

réseau de distribution.

La lecture des btes permet de reconntre la présence de coliformes par

les caractéristiques suivantes :

– coloration jaune, orange des colonies, résultant de l’absence de réduction du TTC par les coliformes ; en général, les Escherichia coli provoquent

758



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Bactéries indicatrices de contamination et d'efficacité de traitement

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×