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Méthodes générales d'examen bactériologique des eaux

Méthodes générales d'examen bactériologique des eaux

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3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.1 Méthodes générales de dénombrement

après concentration



■ Matériel pour filtration sur membranes

Plusieurs modèles d’appareil de filtration sont commercialisés. Ils comprennent tous les

éléments de base suivants, dont l’assemblage est schématisé dans la figure ci-dessous.

Entonnoir-Réservoir (1)

Membrane

filtrante (4)



Plaque

poreuse (3)



Dispositif

d’assemblage (6)

Support

métallique (2)

Robinet (5)



Bouchon caoutchouc



Fiole à vide

Vide



Coupe schématique d’un appareil de filtration sur membranes



– Un entonnoir-réservoir (1) cylindrique ou conique, en acier inoxydable ou plastique à

usage unique, de taille variable généralement de 50 à 500 mL, gradué. Ce réservoir est

destiné à être appliqué exactement sur la surface plane, cylindrique, du support métallique lui servant de base.

– Un support métallique (2) formant une sorte de cuvette conique dont le bord supộrieur

reỗoit une plaque poreuse (3) (généralement de 50 mm de diamètre) destinée à supporter

une membrane filtrante (4) de même diamètre. La partie inférieure de la cuvette est prolongée par un tube creux, muni d’un robinet (5), permettant le passage d’une aspiration

par trompe à vide et l’évacuation du liquide filtré.

– Un dispositif d’assemblage (6) des deux pièces précédentes, variable selon le modèle

d’appareil (collier de serrage, pince amovible, clip, etc.) permet de solidariser réservoir

et support et d’assurer l’étanchéité, en évitant toute fuite du liquide contenu dans le

réservoir.

– Un matériel de liaison supportant l’ensemble de cet appareil de filtration et le reliant à

un dispositif d’obtention du vide. Dans sa version la plus simple, représentée sur le

schéma, il consiste en une fiole à vide en verre, de capacité suffisante pour éviter des

vidanges trop fréquentes de l’eau filtrée (5 litres par exemple), reliée à une trompe à eau

ou une pompe à vide par l’intermédiaire d’un flacon de garde, muni d’un manomètre.

Dans des dispositifs plus complexes, la fiole à vide est remplacée par une rampe supportant plusieurs appareils de filtration. La face supérieure du support métallique et la plaque

poreuse au contact avec la face supérieure de la membrane sont généralement stérilisées à la flamme.



730



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.1 Méthodes générales de dénombrement

après concentration



Le réservoir peut être stérilisé de la mờme faỗon. Directement au contact des eaux analysộes, son flambage doit être particulièrement soigné ; le refroidissement est alors relativement long, d’où l’avantage des entonnoirs à usage unique.

Les membranes filtrantes utilisées sont généralement constituées par des esters de cellulose ; le diamètre des pores est généralement de 0,45 μm (parfois de 0,22 μm). Un

quadrillage en surface facilite les dénombrements bactériens.



■ Technique de la filtration sur membrane



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



Flamber la face supérieure (plaque poreuse) de l’appareil. Fermer le robinet du support et mettre en marche la pompe à vide. Prélever une membrane stérile en la saisissant par son bord extérieur, avec une pince flambée et refroidie ; la déposer sur la plaque poreuse. L’entonnoir-réservoir

flambé et refroidi est placé au-dessus de la membrane. Installer le dispositif de fixation (dans certains modèles d’appareils, ce dispositif, toujours

prévu, est inutile, l’adhérence du réservoir sur la membrane étant suffisante). Agiter soigneusement le flacon d’eau à analyser et verser l’eau,

stérilement, dans le réservoir jusqu’au repère (50 ou 100 mL selon l’appareil et selon le type d’analyse pratiquée).

Ouvrir le robinet du support suffisamment pour laisser l’eau s’écouler lentement sous l’action du vide. Si le contenu du réservoir correspond à la prise

d’essai nécessaire, rincer avec de l’eau stérile (40 à 50 mL) dès la filtration

terminée. Sinon, fermer le robinet à ce moment-là, remplir à nouveau le

réservoir avec de l’eau à analyser, et rincer lorsque tout l’échantillon a été

filtré. Dès que la membrane part sèche, fermer le robinet, enlever le dispositif de fixation et, avec la pince à creuset, le réservoir.

Prélever la membrane avec une pince flambée en la saisissant par son

extrême bord, et l’introduire sur le milieu de culture choisi ou lui faire subir

le traitement selon la méthode utilisée parmi celles qui seront décrites ultérieurement. Lorsque le volume d’échantillon à filtrer est important, et que

la teneur en matières en suspension n’est pas négligeable, la membrane

peut être colmatée avant l’utilisation complète de la prise d’essai nécessaire à analyser. Plusieurs membranes devront donc être successivement

utilisées.



Remarques

– Un matériel permettant de filtrer au lieu même de prélèvement l’échantillon à

étudier est commercialisé. La membrane peut alors être placée sur un milieu de

transport et transférée après retour au laboratoire sur un second milieu constituant le milieu d’inoculation définitif.

– La membrane peut également être immédiatement placée sur le milieu définitif et aussitôt incubée dans les conditions particulières pour sélectionner les

catégories de germes que l’on veut étudier. Utiliser pour cela, des incubateurs

pouvant fonctionner dans un véhicule.



3.1.3 Dénombrement sur membrane filtrante

La membrane après la filtration peut être déposée sur la surface d’une

gélose. Les bactéries retenues à la surface sont nourries à travers la membrane par les pores de celle-ci.

Dans le cas des eaux d’alimentation ou des eaux de surface de bonne

qualité, il n’y a généralement aucune difficulté à filtrer 100 mL. La sensibilité

731



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.1 Méthodes générales de dénombrement

après concentration



est donc, dans ce cas, 100 fois supérieure à celle obtenue normalement

par incorporation en gélose, 20 fois à celle-ci lorsque l’inoculum peut

exceptionnellement être porté à 5 mL. Pour de telles eaux, des volumes

plus importants peuvent souvent être filtrés.

Limites de confiance à 95 % attachées

au nombre de colonies dénombrées par bte

Nombre n de colonies

par bte



732



Limites de confiance à 95 %

inférieure



supérieure



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70



0

0

0

0

0

1

1

2

3

3

4

5

5

6

7

8

8

9

10

11

15

19

23

27

31

36

40

44

49

53



4

6

8

9

11

12

14

15

16

18

19

20

21

23

24

25

27

28

29

30

36

42

48

54

60

65

71

77

82

88



75



58



93



80



62



99



85



66



105



90



71



110



95



75



116



100



80



121



3.2 Méthodes générales de dénombrement

direct par numération des colonies



Les avantages de cette méthode sont ceux indiqués pour l’étalement en

surface : absence de choc thermique, différenciation plus aisée des colonies, possibilité de repiquage. En outre, la filtration permet de séparer les

bactéries du milieu analysé, donc des éventuels inhibiteurs contenus dans

ce milieu. Néanmoins, il n’est pas possible, sur la surface des membranes

(généralement de 50 mm de diamètre), de dénombrer valablement plus de

80 à 100 colonies car, au-delà, les phénomènes de confluence et surtout

de compétitions sont considérés comme importants. Il convient donc dans

ce cas d’effectuer des dilutions.

De plus, la présence abondante de matières insolubles dans l’échantillon

filtré (fin dépôt minéral, plancton, etc.) peut colmater les pores, faire obstacle au passage des nutriments et donner ainsi des résultats erronés par

défaut.

Le support utilisé pour la membrane peut être soit une gélose pour isolement, le plus souvent sélective en vue de la mise en évidence de germes

ou de groupes de germes déterminés ; soit un tampon absorbant imprégné

de solution nutritive.

Le dépôt de la membrane sur la gélose ou le tampon absorbant doit être

fait avec le plus grand soin, sans permettre à des bulles d’air de séparer en

quelque point que ce soit la membrane de son support. Pour cela, saisir la

membrane par une pince à son extrême bord, la mettre en contact par

l’extrémité opposée avec le support nutritif ; puis la dérouler, en quelque

sorte, sur celui-ci, ce qui assure progressivement le contact.

L’expression des résultats se fait sous forme d’un nombre d’unités formant

colonies (UFC).



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.2 Méthodes générales de dénombrement

direct par numération des colonies

après ensemencement sur (ou dans)

une gélose nutritive

3.2.1 Caractères généraux

Dans ce type de méthodes, les bactéries maintenues dispersées dans un

milieu solide (ou à sa surface), donnent naissance, dans des conditions

favorables, à des colonies isolées les unes des autres qui, de ce fait,

peuvent être directement comptées. Connaissant le volume d’échantillon

ensemencé, il est possible d’exprimer le résultat final du dénombrement en

fonction d’un volume d’eau pris comme unité : x colonies pour 1 mL, ou y

colonies pour 100 mL. On admet comme hypothèse de travail que chaque

colonie correspond à une bactérie, ce qui d’ailleurs en pratique est loin

d’être toujours exact ; plusieurs bactéries s’adsorbent, par exemple, sur une

même particule et ne donnent naissance qu’à une seule colonie.

Parfois, la sélectivité du milieu est telle que le premier dénombrement répond

immédiatement au but de l’analyse ; le plus souvent les colonies dénombrées

(ou une partie d’entre elles) ne sont que « présumées » appartenir au groupe

733



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.2 Méthodes générales de dénombrement

direct par numération des colonies



recherché. Il est alors nécessaire, en principe, de repiquer sur des milieux

confirmatifs toutes les colonies suspectes. Quand leur nombre est petit, c’est

possible ; s’il est élevé, le travail peut devenir considérable. Il est suffisant,

dans ce cas, de confirmer le diagnostic sur un nombre de colonies correspondant à la racine carrée du nombre de colonies suspectes. Le nombre de

colonies satisfaisant à cette confirmation, élevé au carré, additionné, éventuellement, du nombre de colonies considérées comme « positives » dès la

première culture, correspond au résultat du dénombrement dans la prise

d’essai. Il existe deux types de dénombrement sur milieu solide :

– les méthodes par incorporation de la prise d’essai dans la gélose ;

– les méthodes par étalement en surface de la prise d’essai.

Pour toutes les modalités de ces méthodes, la précision et la sensibilité

dépendent de certains facteurs qui leur sont communs.

La précision

Elle dépend, entre autres, du nombre de colonies comptées. Parmi les

diverses indications statistiques permettant d’évaluer les intervalles de

confiance en fonction de ce facteur, citons celles retenues dans The

Bacteriological examination of water supplies :

– Si le compte de colonies est supérieur à 20, la limite inférieure de

cet intervalle est donnée par c – 2 (1 + ǰ˭c ) et la limite supérieure par

c + 2(2 + ǰ˭c ), formules dans lesquelles c est le nombre de colonies comptées. Ces valeurs ne sont d’ailleurs qu’approximatives.

Selon ces données, ces intervalles sont en moyenne pour un compte de

20 colonies de Ȁ 60 %. Ces moyennes deviennent respectivement Ȁ 50 %,

Ȁ 35 %, Ȁ 23 %, Ȁ 15 % et Ȁ 12 % pour des comptages de 30, 50, 100,

200 et 300 colonies.

– Si le compte de colonies est inférieur à 20, les formules précédentes ne

peuvent être utilisées. À titre d’exemple, ces intervalles sont de – 52 % et

+ 84 % pour 10 colonies, – 68 % et + 134 % pour 5 colonies et – 98 % et

+ 460 % pour une colonie.

La sensibilité

Elle dépend du volume d’échantillon qui peut être utilisé comme prise d’essai.

Un seuil de détection peut être défini, c’est-à-dire la présence de

1 colonie sur le milieu de culture ; si la prise d’essai ne peut, dans la technique

choisie, dépasser 0,1 mL, le seuil de détection sera de 10 germes par mL ; si

elle est de 100 mL, elle sera 1 000 fois plus élevée, soit 0,01 germe par mL.

Cependant au seuil de détection, la précision est extrêmement faible. Pour

obtenir une précision de l’ordre de 50 %, il faudrait donc compter 30 colonies, ce qui entrne, dans les exemples choisis, un seuil acceptable de

sensibilité de 300 et 0,3 germes par 1 mL.

Il est possible d’augmenter ces seuils en multipliant les ensemencements,

chacun avec la prise d’essai la plus importante possible pour la technique

choisie.



3.2.2 Dénombrement par incorporation en gélose

La méthode fréquemment utilisée (bactéries ắrobies revivifiables) consiste

à mélanger dans une bte de Pétri de 90 à 100 mm de diamètre, 1 mL

734



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



d’échantillon et 15 mL de milieu gélosé, fondu et ramené à une température

de 45 °C environ. Dans ces conditions, le nombre maximum de colonies

acceptable pour éviter les phénomènes de confluence et de compétition

bactérienne est généralement estimé à 300. Pour avoir une précision de

Ȁ 50 %, nécessitant le comptage de 30 colonies, il conviendra donc de

procéder à des dilutions dans un rapport de 1 à 10, et la sensibilité de la

méthode sera de 30 colonies par mL.

Pour la recherche des bactéries aérobies sulfito-réductrices, on peut mélanger à parties égales échantillon d’eau et milieu à double concentration.

Dans cette technique, le mélange de l’échantillon avec la gélose fondue,

même ramené à la température la plus basse possible c’est-à-dire à 45 °C

environ, peut provoquer un choc thermique préjudiciable aux bactéries

habituées à vivre dans des eaux de température basse. De plus, la culture

par incorporation en gélose n’est pas la plus favorable aux bactéries aérobies strictes.



3.2.3 Dénombrement par étalement en surface

Un faible volume d’échantillon est réparti avec un étaleur stérile (pipette

Pasteur repliée « en rateau » sur la surface d’une gélose en bte de Pétri.

Pour une bte de 90 à 100 mm de diamètre, ce volume ne peut guère excéder 0,2 mL. Le seuil de sensibilité sera donc 5 colonies par mL et, pour une

précision exigée de Ȁ 50 %, la sensibilité acceptable sera de 150 par mL.

Cette technique a l’avantage de ne pas donner lieu à des chocs thermiques. Elle est particulièrement favorable pour les germes aérobies stricts.

Elle permet une différenciation des colonies orientant leur diagnostic et leur

repiquage.



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide par détermination

du nombre le plus probable (NPP)

■ Principe



Cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire (loi

de Poisson). Dans ce type de méthode, les bactéries se multiplient librement

dans le milieu liquide. En cas de présence, l’ensemble du milieu liquide

inoculé vire à la « positivité » (trouble ou virage de l’indicateur). Un jugement

quantitatif est possible en jouant sur les volumes de la prise d’essai.

La précision s’accrt avec le nombre de replicats par dilution si bien que

les microplaques de 12 × 8 puits sont très bien adaptées à la méthode.

Celle-ci permet, en fonction du nombre de tubes ou puits « positifs » dans

chaque série, d’indiquer la valeur statistiquement la plus probable : « nombre le plus probable » (NPP).



735



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



3.3.1 Méthodologie

En pratique, on ensemence des dilutions successives de l’eau à analyser

(par exemple 100, 10 –1, 10 –2) à raison de 3 à 5 tubes de milieu de culture

liquide par dilution (et jusqu’à 96 puits en cas de manipulation en microplaque). On notera le nombre de tubes inoculés présentant une culture visible

indiquant la présence d’au moins un micro-organisme (par exemple 3/3, 1/3

et 0/3 tubes positifs). Il s’agit d’une méthode à réponse quantique (absence

ou présence de culture) et non de type énumératif (comptage de colonies).

Il doit être tenu compte que si l’absence de culture correspond à l’absence

de micro-organismes, plus d’un micro-organisme peut être responsable

d’une culture positive. En effet, à forte concentration, tous les tubes inoculés

ont reỗu plusieurs micro-organismes puis, lapproche dune dilution dite

ô limite », variable selon la concentration de la suspension initiale, certaines

unités inoculộes nayant pas reỗu de micro-organismes apparaợtront nộgatives, tandis que dautres positives en auront reỗu un seul, parfois deux ou

trois. La loi de Poisson (probabilité d’apparition aléatoire des événements

« rares ») estime la probabilité que plus d’un micro-organisme soit responsable d’une réaction positive aux dilutions auxquelles des cultures négatives commencent à appartre (zone de transition).

mx

P(x) = ––– e

x!



–m



P(x) = Probabilité de x individus par unité de volume.

m = Moyenne égale à la variance (σ 2) dans cette distribution binomale

positive particulière.

Ainsi, la probabilité de 0 individu est P(0) = e – m et celle de 1, 2, 3... individus

par unité de volume est P(Ͼ 0) = 1 – e – m dans un tube positif à la dilution

limite.

Mc Crady puis De Man ont proposé le calcul mathématique de l’estimation

du NPP de micro-organismes initialement présents dans la suspension,

fondé sur un modèle de distribution de Poisson. Le NPP est donné par la

résolution de l’équation :

pi mi e –vi d

Σ (ni – pi) vi = Σ ––––––––––

1 – e –vi d

ni = Nombre de tubes par dilution.

pi = Nombre de tubes positifs à cette dilution.

vi = Volume inoculé par tube.

d = Estimation du NPP.

Les tables, en fonction du nombre caractéristique (nombre de puits positifs

pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et

son intervalle de confiance (dans l’exemple choisi, nombre caractéristique :

3 – 1 – 0, 1 mL de chaque solution ayant été ensemencé, NPP = 43/mL,

intervalle de confiance 7 à 210).

En pratique, par suite de l’utilisation de milieux sélectifs ou d’une réaction

biochimique spécifique, on peut mettre en évidence la présence ou l’absence d’une bactérie appartenant à un groupe particulier : coliformes, entérocoques (on parle aujourd’hui d’entérocoques pour parler de strecptocoques d’origine fécale), Escherichia coli, etc.

736



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



Si la modification peut provenir de la présence d’autres germes que ceux

recherchés, il convient, sur le contenu de chaque tube positif, de procéder

à un examen complémentaire, pour confirmer ou non la présence

jusqu’alors présomptive des germes recherchés. C’est bien entendu du

nombre de ces tubes confirmés « positifs » dans chaque série, dont il est

tenu compte pour exprimer le résultat.

Dans les systèmes proposés ci-dessous, les volumes prescrits d’ensemencement atteignent 10 mL. Or, il n’est pas possible d’inoculer à un milieu de

culture plus de 10 % de son volume sans risquer de modifier, du fait de la

dilution, les conditions de culture. Aussi, est-il préférable d’user d’un artifice,

en préparant des milieux à « double concentration » où tous les ingrédients

ont été introduits en concentration double de celle prescrite par la formule.

L’addition à un tel milieu concentré d’un volume égal d’échantillon d’eau à

analyser, rétablit la concentration normale d’utilisation.



3.3.2 Systèmes d’ensemencement

Les cinq systèmes retenus dans ce manuel sont les suivants :

1. Trois tubes sont ensemencés avec chacun 10 mL d’eau, trois autres

avec chacun 1 mL d’eau, trois autres avec 0,1 mL d’eau (soit 1 mL d’eau

diluée au 1/10).

2. Système analogue au précédent ; mais l’ensemencement porte sur cinq

tubes par série au lieu de trois.

3. Cinq tubes sont ensemencés avec chacun 10 mL d’eau, un tube avec

1 mL, un tube avec 0,1 mL (soit 1 mL d’eau diluée au 1/10).

4. Un tube est ensemencé avec 50 mL d’eau, cinq autres avec chacun

10 mL, cinq autres avec chacun 1 mL.

5. Utilisation des 96 puits d’une microplaque pour différentes dilutions.

Effectuer le choix en fonction de la concentration présumée en microorganismes dans l’eau à analyser et de l’intervalle de confiance souhaité.

Lecture des résultats

La période d’incubation terminée, dénombrer dans chaque série le nombre

de tubes positifs. Les éventualités les plus courantes sont indiquées dans

les tables ci-jointes.

Pour chacune de ces éventualités sont indiqués :

– le nombre le plus probable (NPP) de germes contenus dans 100 mL de

lộchantillon analysộ,

les limites infộrieures et supộrieures en deỗa et au-delà desquelles il n’y

a que 5 % de chances d’obtenir des valeurs.

Si aucune indication de la table ne correspond aux résultats observés (par

exemple dans le système n° 1 : 3 tubes positifs pour les prises d’essai de

10 mL, 0 pour les prises d’essai de 1 mL, 3 pour les prises d’essai de

0,1 mL), il est possible d’indiquer, sous réserves, un résultat par analogie ;

il serait préférable, si cela était possible, de procéder à une nouvelle analyse (sur un nouvel échantillon) car le résultat obtenu a tellement peu de

chance d’être rencontré, que la possibilité d’une erreur de manipulation doit

être envisagée.



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



737



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



L’utilisation de ces systèmes, dans le seul cadre des quantités d’ensemencement indiquées, ne permet pas le dénombrement des germes dans les

eaux très contaminées. Mais les systèmes demeurent valables si, diminuant d’une (ou n...) puissance de 10, la quantité inoculée dans chaque

série, le résultat donné par les tables est également augmenté d’une (ou

n...) puissance de 10. De même, la sensibilité de la méthode peut être

accrue pour les valeurs les plus basses en augmentant d’une ou plusieurs

puissances de 10 la quantité d’eau ensemencée dans chaque série et en

diminuant de même la valeur du résultat.

C’est ainsi que, dans le premier système, les résultats sont :

– divisés par 10, si l’ensemencement est fait avec 100 – 10 – 1 mL ;

– multipliés par 10, si l’ensemencement est fait avec 1 – 0,1 – 0,01 mL .

– multipliés par 100, si l’ensemencement est fait avec 0,1 – 0,01 – 0,001 mL,

etc.

Dans le cas d’analyses d’eaux de qualité bactériologique inconnue, le nombre de séries utilisées peut être augmenté. Quel que soit ce nombre, la

règle générale à observer pour qu’une lecture soit correcte est la suivante :

la lecture se fait sur trois séries successives d’ensemencements et trois

séries seulement ; la série de base retenue est, parmi les séries où les cinq

tubes sont positifs, celle correspondant à la plus petite quantité d’ensemencement ; les deux autres sont les deux séries voisines dont tous les tubes

ne sont pas positifs. Dans l’exemple suivant :

Première série



:+++++



Deuxième série : + + + + +

Troisième série : + + – – –

Quatrième série : + – – – –

Cinquième série : – – – – –

les deuxième, troisième et quatrième séries sont retenues pour la lecture,

et le résultat donné par la table pour un nombre caractéristique de 5, 2, 1

est 70 NPP.

Il peut arriver, rarement mais non exceptionnellement, qu’il y ait des tubes

(ou un tube) positifs à la quatrième série après la série de base. Ces (ou

ce) tubes positifs doivent être considérés comme appartenant au troisième

niveau.

Le résultat suivant :

Première série



:+++ ++



Deuxième série : + + + + +

Troisième série : + + – – –

Quatrième série : + – – – –

Cinquième série : + – – – –

Nombre caractéristique : 5, 2, 1, 1

est à lire comme

Première série



:+++ ++



Deuxième série : + + + + +

738



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



Troisième série : + + – – –

Quatrième série : + + – – –

Cinquième série : – – – – –

Nombre caractéristique : 5, 2, 2

et le NPP correspondant (lu sur les séries 2, 3 et 4) est : 94.

Choix des systèmes

Dans le système n° 1, les intervalles de confiance sont importants. Aussi

est-il préférable de retenir une méthode « à cinq tubes » car la méthode « à

trois tubes » par dilution, trop imprécise, est vouée à l’abandon. Ce système

couvre une gamme de résultats s’étendant de 1 à 1 000 pour trois séries de

dilutions correspondant à l’ensemencement de quinze tubes. Il est possible

dans une certaine mesure d’améliorer la précision en accroissant le nombre de tubes par série. Il faut se rappeler que cette amélioration correspond, en raison du nombre de tubes manipulés, à un accroissement proportionnellement plus important du travail et du cỏt de l’analyse, d’ó

l’intérêt des micro-méthodes utilisant un total de 96 unités d’inoculation

(puits) tout en conservant une charge de travail minime.

Les autres systèmes décrits 3 et 4 utilisent toujours trois séries d’ensemencement mais ces séries sont dissymétriques, et comporte tantôt un tube,

tantôt cinq tubes ce qui rend impossible l’addition de séries supplémentaires permettant de choisir a posteriori la zone de lecture. Cette zone peut

être déplacée en diminuant ou en augmentant l’ensemencement dans la

même proportion, mais elle ne peut être étendue. En réalité ces deux systèmes ne sont intéressants que parce qu’ils permettent une économie de

tubes à ensemencer, par rapport au système n° 2, pour des eaux dont on

prévoit avec assez de probabilité la pollution.

Les anciens systèmes (n° 1 à 4) sont progressivement abandonnés pour

le système n° 5, par ensemencement des 96 puits d’une microplaque, qui

est la méthode d’avenir et dès maintenant, une référence en matière

d’eaux de baignade. La charge de travail est considérablement allégée par

l’utilisation :

– de pipettes multicanaux avec réservoir permettant l’ensemencement des

96 puits (100 μL/puits) en quelques secondes,

– de milieux déshydratés pré-déposés au fond des puits,

– de substrats spécifiques de E. coli ou Enterococcus permettant une lecture-identification rapide.

Toutes ces opérations peuvent être confiées à un automate. La meilleure

précision provient de l’utilisation du nombre important d’unités ensemencées (96) ainsi que de replicata (de 16 à 64 par dilution). Ce système a

apporté une possibilité de standardisation interlaboratoires.

Enfin, rappelons qu’aucune de ces 5 méthodes n’est applicable aux eaux

potables (car nécessitant une détermination sur 100 mL).



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



739



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.3 Méthode générale de dénombrement

en milieu liquide



Système d’ensemencement n° 1 : nombre le plus probable

et intervalle de confiance

Nombre de tubes

donnant une réaction positive sur



740



NPP

dans

100 mL



Limites de confiance

à 95 %



3 tubes

de 10 mL



3 tubes

de 1 mL



3 tubes

de 0,1 mL



Limite

inférieure



Limite

supérieure



0



0



1



3



Ͻ 0,5



9



0



1



0



3



Ͻ 0,5



13



1



0



0



4



Ͻ 0,5



20



1



0



1



7



1



21



1



1



0



7



1



23



1



1



1



11



3



36



1



2



0



11



3



36



2



0



0



9



1



36



2



0



1



14



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Méthodes générales d'examen bactériologique des eaux

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