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Méthodes générales de prélèvement, transport et conservation

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2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.1 Matériel de prélèvement



action sur les bactéries éventuellement présentes, et il est nécessaire

de le détruire. Ajouter dans le flacon de prélèvement avant sa stérilisation, du thiosulfate de sodium à raison de 17,5 mg/L (environ 8 mg par

flacon de 500 mL). Pour les prélèvements d’eau de piscine, la quantité

de thiosulfate sera de 50 mg/500 ml (le flaconnage dans ce cas sera

stérile à l’intérieur comme à l’extérieur). Procéder éventuellement à

cette addition dans le flacon au moment de l’échantillonnage, après

vérification de la présence du désinfectant ; mais la solution doit alors

être parfaitement stérile et cette opération complémentaire complique la

manipulation (la présence de thiosulfate, aux quantités indiquées, n’est

pas gênante pour les analyses bactériologiques d’eau dépourvue de

chlore).

– Il existe dans le commerce des flacons en matières plastiques, à

usage unique, à bouchon vissé avec joint, stérilisés par l’oxyde d’éthylène ou irradiation (1 à 2 . 10 5 Gy) et pouvant contenir du thiosulfate de

sodium. Vérifier dans chaque lot la stérilité de quelques flacons, ainsi

que l’absence d’éthylène résiduel.



2.1.2 Appareils de prélèvement

Lorsque l’échantillon est prélevé à un robinet, au griffon d’une source, au

bord d’une rivière, il n’est pas nécessaire de disposer d’appareils particuliers : le flacon peut être tenu directement par la main de l’opérateur. Il n’en

est pas de même lorsque le prélèvement doit être fait dans un puits, au

centre d’un cours d’eau, en profondeur dans un lac, dans une piscine.

Plongeur

Il s’agit d’un appareil lesté, auquel est fixé le flacon de prélèvement et qui

permet d’entrner celui-ci au-dessous de la surface de l’eau, suspendu à

une corde ; cet appareil peut être descendu au fond d’un puits (du bord de

la margelle), dans un cours d’eau (d’un pont), en profondeur dans un lac

(d’un bateau).

Un modèle aisément réalisable est constitué essentiellement d’un étui

métallique analogue à celui conseillé pour le transport des échantillons, et

dont la hauteur intérieure est très légèrement supérieure à celle du flacon

qu’il contient. Quelques trous à la partie inférieure permettent l’évacuation

de l’eau entourant le flacon, lors de la remontée de l’appareil au-dessus de

la surface. Au fond de l’étui métallique, du plomb assure le lestage. Une

anse permet de l’attacher par un mousqueton à une cordelette d’environ

50 cm, munie à l’autre extrémité d’une boucle. Sur cette anse, des ergots

assurent le maintien du flacon dans l’appareil lors de la plongée. Lorsque

l’anse est rabattue ils s’effacent du dessus du plongeur permettant ainsi

l’introduction ou le retrait du flacon. Le bouchage du flacon est assuré par

l’un des deux procédés décrits précédemment. L’ensemble (appareil,

flacon, cordelette) est entouré d’un papier filtre. Disposer à l’extrémité

supérieure de ce conditionnement la partie distale (boucle) de la cordelette

et éventuellement le bouchon rodé entouré de son enveloppement de

papier filtre. Stériliser l’ensemble à l’autoclave ou au four Pasteur.

Canne de prélèvement

Elle peut être constituée de segments métalliques (montants de tentes par

exemple), d’environ 50 cm s’ajustant les uns au bout des autres. Au dernier,

722



2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.2 Méthodes générales de prélèvement



est soudée une pince de laboratoire permettant le maintien du flacon de

prélèvement. La longueur de l’ensemble est évidemment variable, mais il

est difficile de manipuler des perches qui dépassent notablement 2 m.

Cette canne peut être utilisée pour les prélèvements en piscine (prélèvement réalisé à 30 cm sous la surface).



L’échantillon destiné à l’analyse est prộlevộ de faỗon ờtre le plus exactement possible représentatif du milieu d’où il provient.

Se référer également au paragraphe A-1.1.



2.2.1 Prélèvement à un robinet

Dans ce cas, la manipulation s’effectue dans les meilleures conditions de

stérilité. Avant de procéder au prélèvement proprement dit :

– enlever les brise-jets et tuyaux de caoutchouc adaptés au robinet choisi,

débarrasser celui-ci le cas échéant des concrétions calcaires, qui ont pu s’y

déposer ;

– se laver très soigneusement les mains et avant-bras, les rincer à l’alcool,

laisser sécher ;

– flamber le robinet pendant au moins 1 minute, en utilisant, par exemple,

une lampe à souder portative au gaz butane ;

– ouvrir le robinet et laisser couler 3 à 5 minutes avant de faire le prélèvement. Durant cette attente, et durant le prélèvement, il est utile qu’un assistant maintienne la lampe à souder allumée, un peu au-dessus du robinet ;

l’opérateur, dans ses manipulations, pourra l’utiliser comme un bec bunsen

au laboratoire.

Lorsque le prélèvement est fait par un manipulateur averti, disposant d’un

récipient d’échantillonnage présenté dans le conditionnement normal décrit

précédemment, procéder ainsi :

– dégager de l’empaquetage stérile, le sommet du flacon, ce qui libère le

paquet spécial du bouchon ;

– vérifier que ce paquet est intact, tenir le bouchon de la main gauche par

la partie ronde que l’on sent à travers le papier, déchirer celui-ci pour saisir

le méplat par le petit doigt replié de l’autre main, selon le geste bactériologique habituel, dégager complètement le bouchon de son enveloppe, le

maintenir de cette faỗon, rodage en bas, si possible près de la flamme

durant tout le prélèvement ;

– prendre le flacon de la main gauche, l’approcher des doigts libres de la

main droite, enlever avec ceux-ci le coton bouchant le goulot ;

– flamber rapidement le bord de ce goulot ; remplir presque entièrement le

flacon, flamber à nouveau rapidement le bord du goulot, et mettre le bouchon.

Si un conditionnement simplifié est utilisé, tenir le flacon de la main gauche,

dégager le flacon de son enveloppe, saisir le méplat, retirer le bouchon (ce



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



2.2 Méthodes générales de prélèvement



723



2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.2 Méthodes générales de prélèvement



qui fait tomber la bandelette de papier évitant le grippage) et le maintenir

près de la flamme durant le remplissage du flacon. Pour celui-ci et le reste

de la manipulation, procéder selon les indications ci-dessus.

Le prélèvement terminé, inscrire sur l’étiquette les indications nécessaires

à l’identification du prélèvement. Replacer le flacon dans son enveloppe de

papier, en protégeant préférentiellement le bouchon et le goulot. Sur une

feuille annexe, noter tous les renseignements utiles à l’interprétation de

l’analyse. Introduire le tout, éventuellement, dans l’étui métallique.



2.2.2 Prélèvement dans un puits à l’aide d’un plongeur

Utiliser un plongeur stérile enveloppé de son papier protecteur et d’une

corde, de longueur adaptée à la profondeur du puits, terminée par un

mousqueton. Poser le plongeur sur le sol (recouvert d’un papier ou tissu

propre), dộchirer la partie supộrieure du papier de faỗon à dégager d’une

part le paquet du bouchon, d’autre part la boucle de la cordelette. Engager

cette boucle dans le mousqueton de la corde, dégager de la main gauche

toute la partie supérieure de l’appareil et notamment le goulot du flacon.

Durant ces manipulations prendre soin de ne pas mettre la cordelette en

contact avec le sol. Enlever le coton obturant le goulot, soulever l’appareil,

le dégager totalement du papier protecteur et le descendre lentement dans

le puits, en évitant de toucher les parois de celui-ci.

Si le prélèvement est fait à environ 50 cm de la surface, cas le plus fréquent, arrêter la descente peu avant que le mousqueton, reliant corde et

cordelette, n’atteigne cette surface.

Lorsque le flacon est plein (aucune bulle ne sortant du plongeur), remonter

l’appareil, dégager le flacon en le prenant par la base du goulot (l’anse du

plongeur étant abaissée pour dégager l’ouverture), vider un peu d’eau,

flamber éventuellement le bord du goulot, et l’obturer avec le bouchon

dégagé de son paquet (*).



2.2.3 Prélèvement dans une rivière

Lorsque le prélèvement doit être fait d’un pont, procéder comme dans le

cas précédent, en tenant compte cependant du courant de la rivière (se

placer du côté aval du pont). En outre, le courant emportant rapidement le

plongeur, il y a lieu lorsque celui-ci est descendu presque jusqu’à la surface, de dégager environ 1 m de corde et de lâcher brusquement le plongeur qui pénètre rapidement au sein du liquide et peut partiellement se

remplir avant d’être entrné par le courant à la surface de la rivière.

Recommencer deux ou trois fois cette opération, si nécessaire, jusqu’au

moment où l’absence de bulles témoigne du remplissage du flacon.



2.2.4 Prélèvement dans un lac ou une rivière profonde

Procéder de la même faỗon. Pour obtenir un ộchantillon une profondeur

fixe, il est nécessaire d’avoir un lestage important, de dégager la longueur

de corde correspondant à la profondeur choisie et de laisser tomber brus(*) Si le prélèvement est effectué à une profondeur supérieure à 50 cm, et si toute contamination doit être

éliminée (cas de sources d’eaux minérales par exemple), stériliser la corde ou disposer d’une cordelette

plus longue.



724



2.3 Prélèvements avec concentration

de la population bactérienne



quement le plongeur. Si le goulot est étroit, le volume du flacon suffisamment important, la profondeur relativement faible, la quantité d’eau pénétrant au cours de la descente est négligeable. Il est possible d’utiliser des

appareils spéciaux ne s’ouvrant qu’une fois la profondeur désirée atteinte,

et qui autorisent une meilleure précision. Dans le cas d’une rivière profonde, où existe un courant notable, il est nécessaire que cet appareil soit

d’un poids très élevé et d’une forme particulière pour échapper dans une

certaine mesure à l’entrnement par le courant. Il s’agit d’instruments de

prix élevé, dont la description et l’utilisation dépassent le cadre de ce

manuel.



2.2.5 Prélèvement aux griffons des sources

Il convient d’isoler en premier lieu le point d’émergence de l’eau, et de préparer un emplacement de captage, soit en enfonỗant dans le griffon un

tuyau qui canalisera leau et facilitera le prélèvement soit, si l’eau sort sans

jaillissement du sol, en amộnageant une rigole. De toute faỗon, ces manipulations ne doivent jamais être faites immédiatement avant le prélèvement, mais au moins 24 heures à l’avance.



2.3 Prélèvements avec concentration

de la population bactérienne

(méthode de Moore)

par adsorption sur de la gaze hydrophile



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



2 • Méthodes générales

de prélèvement



Ces types de prélèvements sont utilisés pour rechercher une espèce bactérienne qui risque de ne se trouver qu’en très faible quantité dans l’eau à

analyser. C’est le cas par exemple des recherches de bactéries pathogènes comme les Salmonella dans les rivières ou les eaux de distribution

publique. La concentration est obtenue par des dispositifs qui captent les

bactéries contenues dans un très grand volume d’eau et permettent de les

isoler de ce milieu liquide.

■ Principe



Obtenir un échantillon enrichi en bactéries en utilisant le liquide d’expression d’un tampon de gaze hydrophile immergé dans un courant de l’eau à

étudier, pendant un temps donné.



2.3.1 Prélèvement dans les eaux de surface

■ Matériel spécial

– Tampon. Dans une pièce de gaze de 3 × 0,64 m, découper six morceaux de 0,64 × 0,50 m

et les superposer. De part et d’autre d’une zone médiane de 0,50 m sur environ 0,08 m

et perpendiculaire à elle, découper de chaque cơté des bandes d’environ 0,28 × 0,10 m.

Replier les deux côtés l’un sur l’autre et ensuite les bandes en accordéon. Attacher solidement le tout par un cordon, d’abord passé entre les deux côtés, au voisinage de la

pliure médiane, puis serré extérieurement de manière à former une sorte de « tête » ; les

extrémités libres sont attachées pour former une boucle.



725



2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.3 Prélèvements avec concentration

de la population bactérienne



Ainsi, se trouve réalisé un tampon composé de 72 lambeaux réunis ensemble à l’une de

leurs extrémités et libres à l’autre. Les décoller les uns des autres afin de donner au

tampon un plus grand volume et de permettre un meilleur passage de l’eau et surtout une

meilleure fixation des particules et bactéries. Chaque tampon empaqueté dans un papier

filtre est stérilisé par séjour au four à 150 °C pendant 2 heures.

– Lest. 5 kg au moins, avec un système d’anneau permettant l’attache de la corde.

– Corde. En nylon, ou mieux en tergal de 6 mm de diamètre. Une longueur de 10 m est

à prévoir.

– Mousqueton. Fort, de 6 à 7 cm de long, en bronze ou en inox, muni d’un « émerillon ».

Par rapport au lest, fixé à l’extrémité de la corde, le mousqueton destiné à recevoir la

boucle du cordon maintenant la « tête » du nouet de gaze est placé de manière que le

tampon puisse flotter à environ 1 m au-dessous de la surface de l’eau.



■ Mode opératoire



Pose

Choisir l’emplacement de manière à ce que le câble soit fixé solidement au

bord de la rivière et à l’abri de la curiosité des passants. Le courant, en cet

endroit, doit être suffisant pour qu’il y ait circulation d’eau à travers ou sur

le tampon, mais cependant pas trop fort pour éviter qu’il soit « lavé ». En

aucun cas le tampon ne doit être immergé dans une eau immobile.

Retrait

Après un temps de contact de 24 heures en moyenne, retirer la tampon

avec les précautions requises pour éviter toute contamination étrangère, et

le placer dans un bocal stérile ; libérer la boucle du cordon du mousqueton

pour que le tampon tombe directement dans le bocal ; se munir d’une paire

de gants stériles en cas d’incident. Au cours du repêchage, procéder de

manière à ce que la tampon reste bien imprégné d’eau.

Extraction

À l’arrivée au laboratoire, déposer le tampon de gaze dans une cuvette

stérile d’un diamètre de 25 cm environ. Toutes les manipulations d’extraction doivent être faites avec des gants stériles. Décoller les bandes les unes

des autres, puis malaxer l’ensemble du tampon vigoureusement avec les

deux mains, de maniốre exprimer le maximum de liquide. Un rinỗage

terminal avec 50 mL d’eau permutée stérile complète l’opération. Recueillir

la totalité de l’extrait (de l’ordre de 350 mL) dans un flacon ou une éprouvette stérile. L’ensemencement doit être immédiat.



2.3.2 Prélèvement au robinet de distribution

Matộriel spộcial

Tampon. Prộparộ de la faỗon décrite précédemment.

– Tube de plastique. Utiliser un tube de plastique d’environ 35 à 40 cm de longueur et

10 cm de diamètre bouché aux deux extrémités par un couvercle vissé avec des joints étanches. Chaque couvercle porte en son centre une embouchure de 1 cm de diamètre environ

et de 2 à 3 cm de longueur, sur laquelle peut être fixé un tuyau, reliant le tube, d’une part au

robinet de distribution, d’autre part à un évier, ou à un quelconque système d’évacuation des

eaux. Le tampon de gaze doit être fixé, par sa partie supérieure, à l’extrémité du tube relié

au robinet. Introduire le tampon de gaze dans ce tube. Stériliser à l’autoclave.



726



2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.4 Transport et conservation

au laboratoire



■ Mode opératoire



2.4 Transport et conservation au laboratoire

La teneur initiale en germes des eaux risque de subir des modifications

dans le flacon, après le prélèvement. C’est pour cela que toute analyse doit

être effectuée le plus rapidement possible. L’évolution est d’ailleurs assez

difficile à prévoir et dépend de nombreux facteurs : température, concurrence bactérienne des espèces présentes, composition chimique de l’eau.

À ce sujet la circulaire du 21 janvier 1960, relative aux méthodes d’analyse

bactériologique des eaux d’alimentation spécifie : « si la durée du transport

dépasse 1 heure, et si la température extérieure est supérieure à 10 °C, les

prélèvements seront transportés dans des glacières dont la température

doit être comprise entre 4 à 6 °C. Même dans ces conditions, l’analyse

bactériologique doit débuter dans un délai maximal de 8 heures, après le

recueil de l’échantillon ».



B

ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



Adapter le tube à un robinet de distribution après avoir stérilisé celui-ci à la

flamme. Ouvrir le robinet et assurer une lente circulation de l’eau dans le

tube : un débit trop rapide gênerait la fixation des particules solides ou risquerait d’entrner celles déjà fixées.

Il est facile de mesurer le débit d’eau circulant dans le tube et d’après

celui-ci, en fonction de la durée du passage à travers ce dispositif, d’apprécier le volume ayant traversé le système durant le temps de l’expérience.

La gaze peut être transportée au laboratoire dans le tube lui-même, dans les

conditions de température et de temps de transport indiquées ci-après.



Aux États-Unis, pour les eaux d’alimentation, ce délai a été porté à

30 heures et les échantillons peuvent être envoyés par la poste en utilisant

un système de conservation au froid. Il est admis par ailleurs que plus la

pollution microbiologique est grande, plus le délai de conservation doit être

court. Les Standard Methods for Examination of Water and Wastewater

indiquent que les échantillons prélevés dans les eaux de surface polluées

doivent être acheminés en moins de 6 heures au laboratoire. Cependant

des travaux ultérieurs ont montré que les résultats obtenus n’étaient statistiquement pas différents après une conservation de 24 heures. Des travaux

franỗais aboutissent ces mờmes conclusions.

Selon les normes franỗaises et européennes, les échantillons doivent être

maintenus à une température comprise entre 1 et 4 °C dès leur prélèvement. Ils doivent être remis le jour même au laboratoire chargé des analyses. En l’absence de prescription particulière, l’ensemencement doit être

réalisé le plus rapidement possible.

Il est donc admis que le délai maximum entre le prélèvement et le début de

l’analyse ne doit pas excéder 24 heures, l’échantillon étant maintenu à

moins de + 4 °C et qu’il est préférable de raccourcir ce délai lorsque l’eau

est présumée très polluée.

Après la prise d’essai, il est recommandé de placer le reste du prélèvement

non utilisé au réfrigérateur. Il peut arriver en effet que les premières lectures

727



2 • Méthodes générales

de prélèvement



2.4 Transport et conservation

au laboratoire



bactériologiques, 24 ou 48 heures après l’ensemencement, donnent des

résultats inattendus, incitant à vérifier l’analyse. Un tel examen de contrôle

n’aura évidemment qu’une valeur indicative, utile cependant à un bactériologiste très averti pour juger de l’opportunité d’un nouveau prélèvement.

Mais aucune valeur ne pourrait être accordée à une vérification pratiquée

sur des échantillons conservés à la température du laboratoire.



Méthodes de référence

NF EN ISO 19458 (novembre 2006). Qualité de l’eau – Échantillonnage

pour analyse microbiologique.

NF EN ISO 5667-3 (juin 2004). Qualité de l’eau – Échantillonnage –

Partie 3 : lignes directrices pour la conservation et la manipulation des

échantillons d’eau.



728



3 • MÉTHODES GÉNÉRALES

D’EXAMEN BACTÉRIOLOGIQUE

DES EAUX



Un jugement sur la qualité bactériologique d’une eau ne peut être porté une

fois pour toutes, à la suite d’une analyse initiale ; il doit, au contraire, dépendre d’une surveillance analytique qui ne peut, actuellement, être continue

pour des raisons techniques ou financières, mais qui doit comporter une

fréquence souvent importante d’examens. Les méthodes d’analyse doivent

donc être praticables en grandes séries, et avoir le plus bas prix de revient.

Dans la plupart des examens usuels, l’analyse bactériologique n’est pas

seulement qualitative mais aussi quantitative. Dans les eaux très polluées,

il convient donc de pratiquer de nombreuses dilutions (eaux de rivière, eaux

usées, etc.). Dans d’autres cas, comme dans celui des eaux destinées à

l’alimentation, au thermalisme, à la baignade, les exigences réglementaires

imposent une sensibilité telle qu’une concentration est au contraire nécessaire (absence de bactéries dans 100, 250, 1 000 mL).

Ces déterminations qualitatives et quantitatives sont établies à partir :

– soit d’un dénombrement direct des colonies après concentration par filtration ou inoculation d’un volume donné de l’échantillon en milieu solide ;

– soit d’une évaluation par calcul statistique du nombre le plus probable

d’unités infectieuses (NPP), après répartition de l’inoculum dans un certain

nombre de tubes de milieu de culture liquide ou dans des puits de microplaques contenant un substrat nutritif déshydraté, et en tenant compte du

nombre respectif de cultures « positives » ou « négatives » obtenues.

Le choix de la méthode dépendra de la nature de l’échantillon mais aussi

de la sensibilité et de la précision souhaitées.



ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX



B



3.1 Méthodes générales de dénombrement

après concentration

3.1.1 Concentration in situ par adsorption

Se reporter au prélèvement avec concentration bactérienne par adsorption

sur de la gaze hydrophile (B.2.3).



3.1.2 Concentration au laboratoire par filtration sur membranes

C’est la technique de concentration la plus utilisée au laboratoire. Le plus

généralement, on procède à une filtration sur membranes en esters de cellulose, de porosité 0,22 μm ou 0,45 μm, susceptibles de retenir les bactéries.

729



3 • Méthodes générales

d’examen des eaux



3.1 Méthodes générales de dénombrement

après concentration



■ Matériel pour filtration sur membranes

Plusieurs modèles d’appareil de filtration sont commercialisés. Ils comprennent tous les

éléments de base suivants, dont l’assemblage est schématisé dans la figure ci-dessous.

Entonnoir-Réservoir (1)

Membrane

filtrante (4)



Plaque

poreuse (3)



Dispositif

d’assemblage (6)

Support

métallique (2)

Robinet (5)



Bouchon caoutchouc



Fiole à vide

Vide



Coupe schématique d’un appareil de filtration sur membranes



– Un entonnoir-réservoir (1) cylindrique ou conique, en acier inoxydable ou plastique à

usage unique, de taille variable généralement de 50 à 500 mL, gradué. Ce réservoir est

destiné à être appliqué exactement sur la surface plane, cylindrique, du support métallique lui servant de base.

– Un support métallique (2) formant une sorte de cuvette conique dont le bord supộrieur

reỗoit une plaque poreuse (3) (généralement de 50 mm de diamètre) destinée à supporter

une membrane filtrante (4) de même diamètre. La partie inférieure de la cuvette est prolongée par un tube creux, muni d’un robinet (5), permettant le passage d’une aspiration

par trompe à vide et l’évacuation du liquide filtré.

– Un dispositif d’assemblage (6) des deux pièces précédentes, variable selon le modèle

d’appareil (collier de serrage, pince amovible, clip, etc.) permet de solidariser réservoir

et support et d’assurer l’étanchéité, en évitant toute fuite du liquide contenu dans le

réservoir.

– Un matériel de liaison supportant l’ensemble de cet appareil de filtration et le reliant à

un dispositif d’obtention du vide. Dans sa version la plus simple, représentée sur le

schéma, il consiste en une fiole à vide en verre, de capacité suffisante pour éviter des

vidanges trop fréquentes de l’eau filtrée (5 litres par exemple), reliée à une trompe à eau

ou une pompe à vide par l’intermédiaire d’un flacon de garde, muni d’un manomètre.

Dans des dispositifs plus complexes, la fiole à vide est remplacée par une rampe supportant plusieurs appareils de filtration. La face supérieure du support métallique et la plaque

poreuse au contact avec la face supérieure de la membrane sont généralement stérilisées à la flamme.



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