Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

3.3.4. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường chọn lọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu

có bổ xung polymicin B và crystal violet); Mơi trường thạch máu cừu/bò.

- Mơi trường đường inulin, mannitol, raffinose, trehalose.

- Môi trường Voges- Proskauer (VP); Môi trường nước thịt có 6,5% NaCl.

- Huyết thanh chuẩn S.suis nhóm D (R,S).

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm được lấy theo triệu chứng lâm sàng:

Dùng dao mổ cắt phần phổi có bệnh tích viêm phổi và cuống họng của

những lợn có triệu chứng điển hình mắc viêm phổi được mổ khám; Con vật

dùng để lấy mẫu đều chưa được sử dụng thuốc kháng sinh điều trị. Các mẫu

bệnh phẩm được bảo quản trong túi nylon vơ trùng ở điều kiện 4ºC và nhanh

chóng được đưa về phòng thí nghiệm.

3.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Với mỗi mẫu bệnh phẩm của vi khuẩn Streptococcus suis tiến hành thí

nghiệm như sau:

- Mẫu bệnh phẩm là phổi và dịch họng của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi.

- Số lượng mẫu bệnh phẩm lấy để xét nghiệm là 30 mẫu , những mẫu lấy có

triệu chứng điển hình mắc bệnh viêm phổi và chưa sử dụng thuốc kháng sinh điều

trị thì được sử dụng lấy mẫu để phân lập vi khuẩn.



- Cấy mẫu bệnh phẩm nghi Streptococcus suis lên đĩa thạch máu (5% máu

cừu). Ria cấy phân tách vi khuẩn Streptococcus suis lên 1 đĩa thạch máu cừu, ủ ở

tủ ấm 37oC có bổ sung 5% CO2 trong thời gian 24 giờ.

- Lựa chọn khuẩn lạc mang hình thái đặc trưng để chuẩn bị nhân giống, sử

dụng thạch máu cừu. Chọn khuẩn lạc cấy chuyển 1 đĩa thạch máu ủ qua đêm.

Tiếp tục nhặt khuẩn lạc từ đĩa thạch máu này cấy lên đĩa thạch máu mới, nuôi

cấy ở tủ ấm 37oC có bổ sung 5% CO2 trong thời gian 24 giờ để cấy thuần các

khuẩn lạc, sau đó tiến hành phương pháp nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa,

kháng sinh đồ.

16



* Quy trình phân lập vi khuẩn Streptococcus suis:

Bệnh phẩm

Soi kính hiển

vi



Ni cấy trên mơi

trường chọn lọc



Thạch máu



Nhuộm Gram

Giám định



Một số đặc tính

sinh hóa



Kết luận:



(+)



(-)



3.4.3. Phương pháp nuôi cấy

3.4.3.1. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch máu

- Công thức:

Pepton

10g

NaCl

5g

Cao thịt

4g

Thạch

20g

Nước cất

1000ml

Máu thỏ hoặc máu cừu 50ml (Máu 5%)

Cách pha chế: Đun sơi hồ tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH

7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn

17



bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Nếu

môi trường màu ngả đen là máu đã chín. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

3.4.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch MacConkey

Cơng thức:

Pepton

Muối mật

Đỏ trung tính

pH

Lactose

NaCl

Thạch

Cách chế: Hòa tan 25g



20g

5g

0,075g

7,4

15g

5g

12g

bột trong 1 lít nước cất. Lắc đều, đun cách thủy



cho bột tan ra hết. Hấp vô trùng ở 121°C/30 phút. Rót ra các đĩa lồng, để nguội

và kiểm tra vơ trùng ở 37°c trong 24 giờ.

3.4.3.3. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường thạch thường

Công thức:

Pepton

10g

NaCl

5g

Cao thịt

4g

Thạch

20g

Nước cất

1000ml

Cách pha chế: Đun sơi hồ tan hồn tồn các thành phần, điều chỉnh pH

7,4-7,6. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống

thạch cho thạch đông.

Nếu đổ đĩa: Sau khi hấp, để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

3.4.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng mọc trên môi trường nước thịt

Công thức :

Cao thịt

NaCl

Pepton

Nước cất



5g

5g

10g

1000ml



Cách pha chế: Đung sôi hòa tan các thành phần, điều chỉnh pH 7,2. Cho

chỉ thị màu Bromthymol blue 1,5ml tới khi có màu xanh lá mạ. Đóng ống 3ml

cho thêm ống durhar. Hấp 121ºC/15 phút.

18



3.4.3.5. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn

Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tiến hành phiết lên

phiến kính, cố định, rồi nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram. Kiểm tra hình

thái vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần.

- Vi khuẩn S.suis: bắt màu Gram dương, xanh đen hoặc tím. Vi khuẩn có



hình cầu, hình bầu dục hoặc hình trứng, đứng thành từng cặp hoặc xếp thành các

chuỗi ngắn.

3.4.3.6. Phương pháp nhuộm Gram



Hình 3.1: Cách tiến hành nhuộm Gram

- Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn

từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm

khơ trong khơng khí.

- Bước 2: Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 - 2 phút, rửa nước, thấm

khô.

- Bước 3: Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol 10% trong 1 - 2 phút, rửa nước,

thấm khô.

- Bước 4:Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô.

- Bước 5: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucsin trong 1 - 2phút, rửa nước, để

19



khơ trong khơng khí. Sau khi nhuộm Gram, đem tiêu bản soi ở vật kính dầu 100x

Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

3.4.4. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa

* Phương pháp xác định một số đặc tính sinh vật, hố học của các chủng vi khuẩn

Streptococcus suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep

Cách tiến hành như sau: mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy thành một

lớp dày đặc trên mặt đĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 37oC/24 giờ (5% CO2).

Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch vi khuẩn từ đĩa thạch, rồi hòa tan vào 2 ml nước

cất vơ trùng để đạt được độ đục tương đương với ống số 4 của dãy so độ đục chuẩn

McFarland. Trong khay nhựa đã có chứa các loại thuốc thử, tiến hành nhỏ khoảng

100l huyễn dịch này vào mỗi lỗ đối với các phản ứng từ VP đến ADH. Phần

huyễn dịch còn lại được trộn đều với 1 ampule môi trường API GP có sẵn trong bộ

kit thử và nhỏ vào các lỗ còn lại, từ ADH đến GLYG. Tồn bộ khay nhựa có chứa

các phản ứng được đặt vào một giá nhựa có chứa khoảng 5ml nước cất bên dưới để

làm ẩm và được ủ ở tủ ấm 37oC. Sau 4 giờ, tiến hành nhỏ các thuốc thử thích hợp:

VP 1 và VP 2 đối với phản ứng VP, NIN đối với phản ứng HIP, ZYM A và ZYM B

đối với các phản ứng PYRA, GAL, GUR, GAL, PAL và LAP, rồi tiến hành

đọc kết quả sau 10 phút. Đối với một số phản ứng, nếu kết quả chưa rõ ràng thì có

thể đọc lại sau 24 giờ.

Cách đọc kết quả: Các phản ứng được đánh giá là dương tính hay âm tính dựa

vào một bảng so màu sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất, được tính điểm và mã

hóa bằng các chữ số. Kết quả xác định của mỗi chủng vi khuẩn cuối cùng sẽ được

hiển thị bằng một dãy số gồm 7 chữ số. Tiến hành tra bảng nhận biết để có thể kết

luận là chủng vi khuẩn kiểm tra thuộc loại vi khuẩn nào.



20



Hình 3.2 : Hệ thống API 20 Strep

3.4.5. Phương pháp xác định Streptococcus suis bằng kỹ thuật PCR

3.4.5.1. Kỹ thuật PCR xác định Streptococcus suis

PCR (Polymerase Chain Reaction) còn được gọi là phản ứng khuếch đại

đoạn gen, đây là phương pháp tổng hợp một đoạn DNA đặc hiệu trong điều kiện

in-vitro với sự xúc tác của enzyme DNA-Polymerase để cắt 1 đoạn DNA đích

cần tổng hợp. Cho đến nay kỹ thuật PCR được xem là một trong những phương

pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại.

3.4.5.2. Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định gen

Bảng 3.1: Trình tự Nucleotide của CPS

Gen



Ký hiệu



đích

CPS



primers

cps2J-F



5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3'



cps2J-R



5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3'



Kích cỡ sản



Chuỗi primers (5 ’ - 3 ’)



phẩm (bp)

1500 bp



Thành phần các chất trong phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích

là 25 µl , được trình bày như sau:



Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR (từ khuẩn lạc)



Thành phần



Thể tích



Thể tích hỗn hợp phản ứng



(μl)



(μl)



21



Mồi xuôi (10 μM/ μl)



0.5



1.0



Mồi ngược (10 μM/ μl)

0.5

1.0

Onetaq2X MasterMix

12.5

25.0

(NEB)

X2

DNA tách chiết

0

0

dd H2O

11.5

23.0

Tổng

25

50.0

Chú ý: Vortex đều hỗn hợp, spin down rồi chia đều ra các ống PCR (25 μl/ ống).

Chấm khuẩn vào các ống kiểm tra.



- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng được thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để

xác định gen mã hoá của vi khuẩn S. suis

Nhiệt độ Thời gian Số chu

Các giai đoạn của phản ứng

(oC)

(phút)

kỳ nhiệt

94

5 phút

1

Giai đoạn tiền biến tính

Giai đoạn biến tính



94



30 giây



Giai đoạn bắt cặp



57



1 phút



35



Giai đoạn tổng hợp



72

72



2 phút

10 phút



1



Giai đoạn kéo dài

- Đọc kết quả của phản ứng:



Sản phẩm thu được là 1500 bp: vi khuẩn S. suis ;

- Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên thạch agarose 2% trong

dung dịch 1xTAE với hiệu điện thế 100V/30 phút, sau đó nhuộm với Ethidium

bromide trong 15 - 20 phút.

- Đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Các vạch ADN được đánh giá

bằng cách so sánh với ADN ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương. Ảnh chụp

được lưu giữ và xử lý kết quả khi cần thiết.

Nếu sau q trình điện di cho kích cỡ là các vạch hiển thị tương ứng với

1500bp thì có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra là S.Suis.



22



3.4.6. Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc

bệnh viêm phổi

Phương pháp quan sát triệu chứng và bệnh tích như sau:

* Kiểm tra bên ngồi: Thể trạng, da, lông, vết thương, các khối u, mụn

nước, vết loét, các lỗ tự nhiên, các khớp vv....

* Mổ khám kiểm tra bên trong.

- Đặt lợn nằm trên bàn mổ dùng dao cắt các cơ trong nách tới khớp xương

bả vai, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang

hai bên cho lợn nằm ngửa trên bàn.

- Dùng dao cắt lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp

lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng để

bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.

- Quan sát những biến đổi bên ngoài các tổ chức đã ghi ở mục 2.2 về màu

sắc, kích thước, hình dáng .v.v...

- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm.

- Dùng dao cắt các cơ hai bên cằm giữ lưỡi, kéo lưỡi ra khỏi xoang miệng,

kiểm tra xoang miệng.

- Cắt các tổ chức giữ lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cùng cắt đứt

thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành, lấy các tổ chức trong cổ, ngực , rửa

trong nước để kiểm tra chi tiết bên ngoài.

- Chú ý: Trước khi cắt thực quản dùng dây buộc phía dưới tránh thức ăn

và dịch từ dạ dày tràn ra.

- Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên

trong tim .

- Rạch kiểm tra hạch Amidan, thanh quản, khí quản, phế quản, phế nang phổi.

- Rạch kiểm tra thực quản.

- Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra về màu sắc, kích thước, độ cứng

mềm, ký sinh trùng .v.v...

- Kiểm tra tuyến tuỵ.



23



- Cắt đứt da, cơ dọc theo khớp bán động háng, dùng mũi dao tách rời

khớp bán động háng, bộc lộ xoang chậu.

- Loại bỏ màng treo ruột, kéo dạ dày, ruột non, ruột già tới tận hậu mơn

để ra ngồi kiểm tra sau cùng, tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.

- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng đối với

con cái; dịch hoàn, ống dẫn tinh với con đực) cả bên ngoài và bên trong.

- Kiểm tra bên ngồi thận, ống dẫn niệu, bóng đái, tiếp tục mổ kiểm tra

bên trong.

- Kiểm tra hệ thống hạch trong cơ thể.

- Rạch kiểm tra hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn đặc

biệt chú ý tới vùng van hồi manh tràng về các chất chứa, dịch, màu sắc, điểm

hoại tử, xuất huyết .v.v...

- Cắt kiểm tra dịch, màu sắc các khớp xương, chẻ để kiểm tra tuỷ xương

bên trong.

- Cắt đầu lợn ở đốt sống Atlas, lột da, dùng đục hoặc cưa cắt từ lỗ chẩm

sang hai bên đến cạnh trước xương trán, lật xương hộp sọ, bộc lộ não. Dùng kéo

cong vô trùng tách màng não, cắt đứt các dây thần kinh lấy não. Tuyến yên cũng

được kiểm tra, nằm ở ngay dưới xương bướm.

- Dùng cưa cắt ngang xương mũi để kiểm tra xoang và các ống cuộn.

3.4.7. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các

chủng vi khuẩn S.suis phân lập được

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hiton;

- Vi khuẩn S. suis nuôi cấy trong môi trường thạch TSA qua đêm. Các khuẩn

lạc của các vi khuẩn được tạo huyền phù trong nước muối sinh lý 0,9% để được độ

đục tương đương ống McFarland 1 (3 x 108 CFU/ml). Dùng tăm bông vô trùng, tẩm

dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton;

- Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid

(Anh) lên mặt đĩa thạch;

- Bồi dưỡng đĩa thạch ở 37oC/18 - 24 giờ (5% CO2). Đọc kết quả bằng cách

24



đo đường kính vòng vơ khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn

cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (bảng 3.3).

Bảng 2.5: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng

sinh (NCCLS - 2002) [29]

Đường kính vòng vơ khuẩn (mm)

Loại

Hàm lượng

kháng sinh

Mạnh

Trung bình Kháng thuốc

1 Ceftiofur

30 µg

≥ 21

18 - 20

 17

2 Ampicillin

10 µg

≥ 22

19 - 21

≤ 18

3 Amoxicillin

20 µg

≥ 20

≤ 19

4 Neomycin

30 µg

≥ 17

13 - 16

≤ 12

5 Amikacin

30 µg

≥ 17

15 - 16

≤ 14

6 Gentamicin

10 µg

≥ 19

≤ 15

7 Lincomycin

15 µg

≥ 15

13 - 14

≤ 12

8 Colistin

10 µg

≥ 15

13 - 14

≤ 12

9 Tetracyclin

30 µg

≥ 29

26 - 28

≤ 25

10 Erythromycin

15 µg

≥ 21

16 - 20

≤ 15

11 Florfenicol

30 µg

≥ 23

≤ 20

3.4.7. Phương pháp thử phác đồ điều trị

TT



Căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn

Streptococcus suis phân lập được, chúng tôi lựa chọn 3 loại thuốc kháng sinh

mẫn cảm cao, đang được phép lưu hành tại Việt Nam. Kết hợp với các loại thuốc

điều trị triệu chứng, trợ sức, trợ lực, xây dựng lấy 3 phác đồ và tiến hành thử

nghiệm điều trị. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ

được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:

- Số lợn mắc viêm phổi ở cùng một địa phương được phân ra ngẫu nhiên

làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh;

- Số lần và ngày điều trị được dùng đồng đều trong các phác đồ;

- Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần về

hiện tượng ho, thở, tình trạng ăn, uống … sau 10 ngày kể từ khi dùng thuốc.

- Các phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh như sau:

+ Phác đồ 1: Điều trị nguyên nhân lợn mắc viêm phổi dùng thuốc kháng

sinh 1 do công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần ceftiofur:

10g/100 ml), tiêm bắp với liều lượng: 1ml/25 kg thể trọng/ngày; tương ứng là 4

mg ceftiofur/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ (3 ngày tiêm 1 lần).

25



Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-KCNAMIN, tiêm bắp với liều: 1ml/10 kg thể trọng/ngày (tiêm 1 lần/ngày).

+ Phác đồ 2: Dùng thuốc kháng sinh 2 do công ty cổ phần thuốc thú y

Marphavet sản xuất (thành phần amoxicillin:15g/100 ml), tiêm bắp với liều

lượng 1 ml/10 kg thể trọng/ngày; tương ứng là 15 mg amoxicillin/kg thể trọng;

thuốc tác dụng kéo dài 48 giờ (2 ngày tiêm 1 lần).

Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-KCNAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày (1 lần/ngày).

+ Phác đồ 3: Dùng thuốc kháng sinh 3 do công ty cổ phần thuốc thú y

Marphavet sản xuất (thành phần florfenicol: 45g/100 ml), tiêm bắp với liều

lượng 1 ml/30 kg thể trọng/ngày; tương ứng là 15 mg florfenicol/kg thể trọng;

thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ (3 ngày tiêm 1 lần).

Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-KCNAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày (1 lần/ngày).

3.5. Phương pháp phân tích số liệu

Số liệu thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống

kê sinh học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel.



26



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×