Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

tam giác chứa 50 ml mơi trường MS lỏng (phụ lục) có bổ sung 0,1 mg/l BA

(môi trường đã tiệt trùng ở 120 oC trong 20 phút). Sau đó, ta bổ sung EMS

vô trùng với các nồng độ tương ứng 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.15%, 0.20%,

0.25%, 0.30% rồi đem lắc với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 2h. Mỗi

cơng thức xử lý thực hiện với 60 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại (20 mẫu/bình

xử lý). Sau thời gian xử lý, các chồi cúc được đưa vào bốc cấy, rửa sạch

bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần, thấm khô và cấy vào môi trường nhân

nhanh hoa cúc in vitro.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hồn tồn ngẫu nhiên

+ Mơi trường nuôi cấy: MS + 30g/l đường saccharose + 100ml/l

nước dừa + 100mg/l myo inosytol + 0.1mg/l BA + 5g/l agar, pH= 5.7. Môi

trường được khử trùng ở 121ºC trong thời gian 20 phút.

+ Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ nuôi cấy 24ºC ± 2ºC, cường độ ánh

sáng 2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng – 10h tối

+ Cơng thức thí nghiệm:

 Cơng thức 1: Đối chứng (xử lý EMS 0.00%)

 Công thức 2: Xử lý EMS 0.05%

 Công thức 3: Xử lý EMS 0.10%

 Công thức 4: Xử lý EMS 0.15%

 Công thức 5: Xử lý EMS 0.20%

 Công thức 6: Xử lý EMS 0.25%

 Công thức 7: Xử lý EMS 0.30%

+ Phương pháp theo dõi : Theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần , 4

tuần sau cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống % =

 Tỷ lệ bật chồi (%) =

 Hệ số nhân chồi =

 Chiều cao trung bình (cm) =

 Số lá trung bình (lá)=

 Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =



Khóa luận tốt nghiệp



20



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

2.2.2. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím

(UV) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995).

+ Phương pháp thực hiện: Các đoạn thân mang mắt ngủ (1 – 1.5 cm)

được cắt từ chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro và cấy vào

môi trường nhân nhanh hoa cúc. Sau đó, các bình ni cấy này được đem

xử lý tia cực tím có cường độ 2025 candela trong các khoảng thời gian: 2

giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ. Sau xử lý bằng tia cực tím các mẫu được chuyển

sang phòng ni cấy ở nhiệt độ 240C ± 20C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu

sáng 2000 -2500 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng/8h tối. Mỗi công thức

thực hiện trên 9 bình (6 mẫu/bình), chia làm 3 lần nhắc lại.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hồn tồn ngẫu nhiên

+ Mơi trường ni cấy : MS + 30g/l đường saccharose +100ml/l

nước dừa + 100ml/l myo inosytol + 0.1 mg/l BA + 5g/l agar, pH= 5.7. Môi

trường được khử trùng 121ºC trong thời gian 20 phút.

+ Công thức thí nghiệm:

 Cơng thức 1: Đối chứng (khơng xử lý tia cực tím)

 Cơng thức 2: Xử lý tia cực tím trong 2h

 Cơng thức 3: Xử lý tia cực tím trong 4h

 Cơng thức 4: Xử lý tia cực tím trong 6h

 Cơng thức 5: Xử lý tia cực tím trong 8h

+ Phương pháp theo dõi: Theo dõi , đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần , 4

tuần sau cấy chuyển và thực hiện qua 2 lần cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống % =

 Tỷ lệ bật chồi (%) =

 Hệ số nhân chồi =

 Chiều cao trung bình (cm/ cây ) =

 Số lá trung bình (lá) =

 Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =

Khóa luận tốt nghiệp



21



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

2.2.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc

vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995).

+ Phương pháp thực hiện: Các chồi ngọn (1,5 – 2 cm) thu được từ

các chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro sau xử lý EMS (thu

được từ nội dung 1) được cắt và cấy chuyển vào môi trường ra rễ. Mỗi

công thức thực hiện trên 9 bình (6 mẫu/bình), chia làm 3 lần nhắc lại.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hồn tồn ngẫu nhiên.

+ Môi trường ra rễ : MS +30g/l đường saccharose +100ml/l nước

dừa + 100mg/l myo innosytol + 5g/l agar, pH= 5.7. Mơi trường được khử

trùng 121ºC

+ Cơng thức thí nghiệm:

 Công thức 1: Đối chứng (chồi cúc xử lý EMS 0.00%)

 Công thức 2: Chồi cúc xử lý EMS 0.05%

 Công thức 3: Chồi cúc xử lý EMS 0.10%

 Công thức 4: Chồi cúc xử lý EMS 0.15%

 Công thức 5: Chồi cúc xử lý EMS 0.20%

 Công thức 4: Chồi cúc xử lý EMS 0.25%

 Công thức 5: Chồi cúc xử lý EMS 0.30%

+ Phương pháp theo dõi: Đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần sau cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống % =

 Chiều cao trung bình (cm/ cây ) =

 Số lá trung bình (lá )=

 Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =

 Số chồi trung bình (chồi/ mẫu ) =

 Số rễ =

 Chiều dài rễ (cm) =



2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của

chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý tia UV.

Khóa luận tốt nghiệp



22



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

+ Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995).

+ Phương pháp thực hiện: Các chồi ngọn (1,5 – 2 cm) thu được từ

các chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro sau xử lý tia cực tím

(UV) (thu được từ nội dung 2) được cắt và cấy chuyển vào môi trường ra

rễ. Mỗi công thực hiện trên 9 bình (6 mẫu/bình), chia làm 3 lần nhắc lại.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hồn tồn ngẫu nhiên.

+ Môi trường ra rễ: MS +30g/l đường saccharose +100ml/l nước dừa

+ 100mg/l myo innosytol + 5g/l agar, pH= 5.7. Môi trường được khử trùng

121ºC trong 20 phut

+ Công thức thí nghiệm:

 Cơng thức 1: Đối chứng (chồi cúc khơng xử lý tia cực tím)

 Cơng thức 2: Chồi cúc xử lý tia cực tím trong 2h

 Cơng thức 3: Chồi cúc xử lý tia cực tím trong 4h

 Cơng thức 4: Chồi cúc xử lý tia cực tím trong 6h

 Công thức 5: Chồi cúc xử lý tia cực tím trong 8h

+ Phương pháp theo dõi: Đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần sau cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống % =

 Chiều cao trung bình (cm/ cây ) =

 Số lá trung bình (lá )=

 Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =

 Số chồi trung bình (chồi/ mẫu ) =

 Số rễ =

 Chiều dài rễ (cm) =

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft office

Excell và Irristat 4.0



Khóa luận tốt nghiệp



23



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nơng - Lâm Bắc Giang

học



Khóa luận tốt nghiệp



24



Khoa Nông



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methane sunfonate (EMS)

tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) in vitro

Các chồi cúc sau khi xử lý EMS ở các nồng độ khác nhau được đem

cấy chuyển vào môi trường nhân nhanh và theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu

vào 2 tuần, 4 tuần sau cấy chuyển. Kết quả theo dõi cho bởi bảng 3.1 và

bảng 3.2 như sau:

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống,

sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc invitro 2 tuần sau cấy chuyển

Chỉ tiêu



Tỷ lệ



Tỷ lệ



Tỷ lệ



Chiều



sống



bật chồi



biến dị



cao



Hệ số

Số lá



nhân



Công thức

(%)

(%)

(%)

(cm)

chồi

CT1 (ĐC)

100.00 100.00

0.00

2.33

3.26

1.73

CT2 (0.05%)

93.33

91.67

3.33

2.03

3.10

1.43

CT3 (0.10%) 86.67

85.00

16.67

1.40

2.66

1.37

CT4 (0.15%)

80.00

76.67

6.67

1.80

3.46

1.48

CT5 (0.20%)

73.33

70.00

8.33

1.90

3.56

1.45

CT6 (0.25%)

70.00

68.33

13.33

1.78

3.43

1.60

CT7 (0.30%)

66.67

65.00

15.00

1.82

3.47

1.52

CV %

6.50

7.60

4.10

LSD0.05

0.27

0.43

0.10

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, 2 tuần sau cấy chuyển, các chồi cúc sau

xử lý EMS đã có sự sinh trưởng thay đổi rõ rệt so với đối chứng.

Trong khi ở công thức đối chứng, 100% mẫu cấy đều sống và bật

chồi thì ở các cơng thức còn lại, khi tăng nồng độ EMS xử lý thì tỷ lệ sống

và tỷ lệ bật chồi của chồi cúc giảm dần. Ở nồng độ 0.30% tỷ lệ mẫu sống

và bật chồi thấp nhất vẫn đạt trên 65%.

Ngược lại, có thể nhận thấy rõ ràng rằng, xử lý EMS đã làm tăng khả

năng xuất hiện chồi cúc biến dị khi tất cả các công thức đã qua xử lý EMS đều

xuất hiện mẫu biến dị. Ngoại trừ công thức xử lý EMS có tỷ lệ biến dị cao

nhất là 16.67% thì trong các cơng thức còn lại, khi tăng nồng độ xử lý EMS

thì tỷ lệ xuất hiện biến dị hình thái cũng tăng. Chứng tỏ, hiệu lực xử lý EMS

Khóa luận tốt nghiệp



25



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

in vitro trên chồi cúc vàng đã làm tăng đáng kể tỷ lệ xuất hiện biến dị và công

thức xử lý EMS 0.10% cho kết quả rất đáng lưu tâm vì tương tác giữa kiểu

gen và môi trường để tạo ra các biến dị hình thái là một xác suất ngẫu nhiên.

Khi xem xét khả năng sinh trưởng (thông qua các chỉ tiêu hệ số nhân

chồi, chiều cao chồi, số lá) của chồi cúc sau xử lý EMS ở thời điểm 2 tuần

sau cấy chuyển có thể thấy: khả năng sinh trưởng của các công thức sau xử

lý EMS đã giảm hơn so với đối chứng. Trong đó, ngoại trừ cơng thức xử lý

EMS 0.10% có khả năng sinh trưởng thấp hơn một cách có ý nghĩa thống

kê thì các cơng thức còn lại sinh trưởng tương đối đồng đều. Điều này có

được là do cơng thức 0.10% đã xuất hiện nhiều thể biến dị có cấu trúc thân,

lá nhỏ hơn hẳn so với chồi cúc in vitro thông thường. Trong các cơng thức

đã qua xử lý EMS in vitro thì cơng thức xử lý EMS 0.20% khả năng sinh

trưởng ưu thế hơn cả.



Hình 3.1. Chồi cúc biến dị thu được khi xử lý EMS nồng độ 0.10%



Chồi cúc bình thường



Chồi sinh trưởng kém,

Chồi có hiện tượng

lá màu vàng xanh

mọng nước, màu nhạt

Hình 3.2. Biến dị hình thái thu được sau xử lý chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) EMS

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống, sinh

trưởng và tạo biến dị của chồi cúc invitro 4 tuần sau cấy chuyển



Khóa luận tốt nghiệp



26



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×