Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro

Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro

Tải bản đầy đủ - 0trang

Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

hướng tạo giống cây trồng quan trọng. Vật liệu xử lý có thể là các cơ quan

đang trong giai đoạn phát triển mạnh: đỉnh chồi, callus… Tác nhân gây đột

biến có thể là tác nhân vật lý hay hoá học.

Xử lý đột biến chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô đã được nhiều nhà khoa

học chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mong

muốn, tạo nguồn vật liệu phong phú cho chọn giống và lai tạo giống. Đồng

thời kỹ thuật này có thể giải quyết vấn đề khó khăn: thể khảm sau xử lý

chiếu xạ. Broetjes và cs năm 1976 đã đưa ra giả thuyết rằng tái sinh in vitro

có thể loại bỏ thể khảm. Vì vậy kỹ thuật này càng có ý nghĩa hơn đối với

cây nhân giống vơ tính, nhờ tiềm năng nhân nhanh trong thời gian ngắn, rút

ngắn chu trình chọn lọc đột biến.

Xử lý đột biến in vitro sẽ giảm tác động không tốt của các tác nhân

gây đột biến tới môi trường, con người và động vật.

(http://www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2005312067)

1.2.2. Cơ chế gây đột biến của Ethyl Methane Sunfonate (EMS)

* Giới thiệu về hóa chất Ethyl methane sulfonate (EMS)

EMS là hợp chất hóa học gây đột biến nằm trong nhóm các hợp chất

alkyl hóa, nhóm này gồm phần lớn các chất hóa học được dùng phổ biến

cho mục đích chọn giống hiện nay như EI, EMS, NEU, NMU… q trình

alkyl hóa là sự thay thế hydro có trong bazo nito bằng một gốc alkyl có

trong các chất alkyl hóa ( như – C2H5 có trong EMS) .

EMS có tên khoa học là Ethylmethane sulphonate, cơng thức hóa

học: CH3 – CH2 – O – SO2 – CH3.

* Cơ chế tác động của EMS:

EMS là chất gây đột biến gen, gây nên những đột biến điểm và mất

đoạn nhỏ ADN. EMS gây alkyl hóa với bazơ nitơ thường xuất hiện ở vị trí

O6 của Guanin khiến cho nó sau đó có thể kết cặp với Thymine và dẫn đến

sự đồng hoán giữa các bazo nito (đồng hoán – transition- là sự thay thế một

purin này bằng một purin khác hoặc một pyrimidin này bằng một pyrimidin

Khóa luận tốt nghiệp



13



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

khác, hoặc sự thay thế một cặp bazo này bằng một cặp bazo khác mà vẫn

giữ nguyên định hướng của purin và pyrimidin (Lê Duy Thành,2001)

Cho ví dụ, nhóm ethyl (CH3- CH2 -) ở vị trí N7 và ở vị trí O6 chắc

chắn là hai hiệu quả tác động của EMS. 7-ethylguanine rồi sẽ cặp đôi với

Thymine làm sai lệch sự cặp đôi theo nguyên tắc bán bảo toàn G – C

( Guanin – Cytozin) (Eldon John Gardner và cs, 1984).

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hóa học EMS là chất được sử

dụng phổ biến và cho hiệu quả cao. Dung dịch hóa chất gây đột biến này

phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc

“stock”. Tốc độ thủy phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp

bán thời gian “hafl life”. Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc

độ thủy phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ. Trong nước cất ( pH

= 7) ở nhiệt độ 20ºC hafl life của EMS là 93 giờ, ở 30ºC là 26 giờ và 37ºC

là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, 2007). Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây

đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và

giữ trong bóng tối suốt thời gian xử lý (Đào Thanh Bằng, 1997).

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một

chất mang có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của

EMS. Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 – 40% và có khả năng tạo

nên đột biến ở tần suất cao cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chí

Bửu, 2007)



Khóa luận tốt nghiệp



14



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nơng - Lâm Bắc Giang

học



Khoa Nơng



Hình 1.1: Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hóa

(Trần Thượng Tuấn, 2005)

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hóa chất EMS trên các bộ

phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển. Tuy nhiên, đối

với mỗi giống bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hóa chất

gây đột biến. Các kết quả nghiên cứu cho thấy. Vì vậy, đối với từng giống,

từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp

lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao.

* Thành tựu về nghiên cứu chọn, tạo giống bằng phương pháp xử lý

đột biến EMS in vitro trên thế giới

Các tác giả Tulman Neto et al. (2004), đã nghiên cứu ảnh hưởng gây

đột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev. Các tác

giả tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv. Ingrid (màu

hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77% trong 1h và 45

phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt. Tiếp theo đó, mẫu

được cấy trên môi trường MS + 1 g/l hydrolyzed casein, 1 mg/l 6-benzyl

laminopurine (BAP) và 2 mg/l indole-3-acetic acid(IAA). Ước lượng có

khoảng 910 mẫu thu được xử lý từ EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa. Thí

nghiệm thu được khoảng 40 dạng đột biến (chiếm khoảng 5,2%) cho màu

Khóa luận tốt nghiệp



15



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

sắc cánh hoa khác nhau( màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng, màu

trắng, màu vàng và màu cam). Hầu hết chúng (89,6% tổng số) là đồng dạng

về kiểu hình.

Chen Wei et al. (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên các

phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassia napus) cho thấy: Khi xử lý các

tiểu bào tử của B.napusin in vitro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0

mM/l và các khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng số

lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ở

các nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý. Sản phẩm phơi giảm còn

một nửa ở nồng độ 2,5 mM/l và khoảng thời gian 24 giờ. Ở mức này, các

tiểu bào tử bị đột biến có giá trị rất quan trọng trong xử lý đột biến EMS in

vitro B.napus.

Tác giả Luan et al. (2007), đã sử dụng EMS nhằm gây đột biến tăng

tính chịu mặn của các giống Khoai lang (Ipomoea batatas L.). Mẫu mô lá

được sử dụng đem xử lý EMS ở nồng độ 0,5% trong thời gian 0; 1,0; 1,5;

2,0; 2,5; và 3,0 ; sau đó tráng lại bằng nước cất vơ trùng 4 lần. Mẫu được

nuôi cấy trên môi trường MS + 200mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tế

bào đột biến và các dòng này sẽ được cấy chuyển 5 lần (20 ngày 1 lần)/. Sau

đó các dòng chọn được cấy chuyển sang mơi trường tạo phơi vơ tính MS + 4

mg/l ABA + 10 mg/l GA. Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường MS +

0,05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT. Các giống như ML1, ML2 và ML3 được

phục tráng từ các dạng phơi vơ tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5%

trong 2 và 2,5 giờ. Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳn

các giống gốc.

* Thành tựu về nghiên cứu chọn, tạo giống bằng phương pháp xử lý

đột biến EMS in vitro trên Việt Nam

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã

gây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất

EMS trong ni cấy mơ. Thí nghiệm được thực hiện từ vụ hè thu năm 1998

đến năm 2001. Đặc điểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ là

Khóa luận tốt nghiệp



16



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

giống đặc sản xuất khẩu của Hoa Kỳ được thế giới ưa chuộng. Khi trồng ở

Việt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, khơng cạnh tranh với các

nước khác, thị trường nội địa cũng khó tiêu thụ. Sau khi xử lý, thế hệ M1,

các cá thể được trồng ở ruộng vào thời điểm có dịch rầy, phần lớn đều bị

cháy rầy. Từ 59 cá thể này, kỹ sư Phạm Thị Hường tiếp tục chọn lọc đến

thế hệ M5, tuyển chọn một số dòng đã thuần đưa vào so sánh năng suất,

trong đó có 4 dòng OM 3566 – 14, OM 3566 – 15, OM 3566 – 16 và OM

3566 – 70 có triển vọng.

Năm 2008, Viện sinh học Nơng nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội triển khai xử lý đột biến bằng EMS trên đối tượng hoa cẩm chướng.

Kết quả cho thấy khi tăng nồng độ EMS đã làm giảm khả năng sống, tăng

tỷ lệ các chồi biến dị. Sau quá trình xử lý thì thu được 5 dạng chồi in vitro

và đã đánh giá được sự sinh trưởng và tạo cây hồn chỉnh của các dạng

chồi đó (Vũ Hồng Hiệp, 2008).

1.2.3. Cơ chế gây đột biến của tia cực tím (UV)

* Giới thiệu về tia cực tím (UV)

Tia cực tím hay tia tử ngoại, tia UV (từ tiếng Anh Ultraviolet)

là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài

hơn tia X. Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng

từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại xa hay tử ngoại chân khơng (có bước sóng

từ 200 đến 10 nm).

Tia cực tím (UV) được phát hiện vào năm 1801 bởi nhà khoa học

người Đức tên Johann Wilhelm Ritter. Sau phát hiện này, những cuộc

nghiên cứu tiếp theo cho thấy trong một dãy ánh sáng mặt trời có đến 3

nhóm tia sáng chính:

+ Nhóm UV-A: Chiếm 97% trong dãy phổ có bước sóng từ 315400nm. Tia này khơng gây ra hiện tượng cháy nắng nhưng cũng đủ gây

thiệt hại cho các axit nucleic trong tế bào da. Chính phát hiện này đã mở

đường đưa nhóm ánh sáng UVA này ứng dụng vào cơng nghệ thuộc da.

Khóa luận tốt nghiệp



17



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nơng

học

+ Nhóm UV-B: Chiếm khoảng 3% dãy phổ, có bước sóng từ 280315nm và chủ yếu xuất hiện trong khoảng thời gian từ 12-16h hàng ngày.

Tia này có khả năng gây cháy nắng, làm giảm khả năng sản xuất collagen

và elastin trên da

+ Nhóm UV-C: Đây là loại có bước sóng ngắn nhất (chỉ từ 100280nm) và cũng là loại có hại nhất. Tia sáng này có thể tiêu diệt acid

nucleic trong các tế bào, phá hủy DNA tồn tại trong các cơ thể sống…

Đến giữa thế kỷ 20, cùng với sự bùng nổ về khoa học công nghệ,

phương pháp tiệt trùng bằng tia cực tím (UVGI) đã được đưa vào thực hành

trong công tác vệ sinh y tế và vô trùng phương tiện làm việc... Từ những

ứng dụng thành cơng trong y tế, UVGI còn được giới khoa học các nước

đưa vào ứng dụng cho công nghệ quốc phòng và cơng nghệ dân dụng…



* Cơ chế gây đột biến của tia UV

Tia tử ngoại (UV) có thể làm cho 2 bazơ Thymine trên cùng 1 mạch

liên kết với nhau dẫn đến đột biến.

Trong trường hợp 2 bazơ Thymine trên cùng một mạch liên kết với

nhau, sau quá trình tái bản DNA, một loạt các DNA “lỗi” được tạo ra. Các

phân tử DNA này bị mất 2 cặp bazơ nitơ so với DNA nguyên bản (hai cặp

T = A, T = A liên tiếp). Kết quả của đột biến mất cặp bazơ nitơ làm thay đổi

số lượng và trật tự sắp xếp các cặp nucleotide trong gen (đặc biệt dẫn tới

làm thay đổi khung đọc mã).

Trong trường hợp đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng, từ một tế bào

bị đột biến thơng qua ngun phân nó được nhân lên thành mơ, có thể di

truyền bằng sinh sản sinh dưỡng. Nếu đó là đột biến gen trội sẽ được biểu

hiện thành một phần của cơ thể, gọi là "thể khảm". Nếu đó là đột biến gen

lặn, nó khơng biểu hiện ra kiểu hình và sẽ mất đi khi cơ thể chết. Đột biến

lặn không biểu hiện thành kiểu hình ở trạng thái dị hợp. Hậu quả làm gián



Khóa luận tốt nghiệp



18



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

đoạn một hay một số tính trạng nào đó (Gen -> mARN -> Protein -> tính

trạng), ít ảnh hưởng đến sức sống và sự sinh sản của sinh vật.



Hình 1.2. Cơ chế gây đột biến của tia UV



CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh

học - Trường đại học Nông - Lâm Bắc Giang

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2018 đến tháng 5/2018

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methane

sunfonate (EMS) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi

cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995).

+ Phương pháp thực hiện: Các đoạn thân mang mắt ngủ (1 – 1.5 cm)

được cắt từ chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro đưa vào bình

Khóa luận tốt nghiệp



19



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Trường Đai học Nông - Lâm Bắc Giang

Khoa Nông

học

tam giác chứa 50 ml mơi trường MS lỏng (phụ lục) có bổ sung 0,1 mg/l BA

(môi trường đã tiệt trùng ở 120 oC trong 20 phút). Sau đó, ta bổ sung EMS

vơ trùng với các nồng độ tương ứng 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.15%, 0.20%,

0.25%, 0.30% rồi đem lắc với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 2h. Mỗi

cơng thức xử lý thực hiện với 60 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại (20 mẫu/bình

xử lý). Sau thời gian xử lý, các chồi cúc được đưa vào bốc cấy, rửa sạch

bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần, thấm khô và cấy vào môi trường nhân

nhanh hoa cúc in vitro.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hồn tồn ngẫu nhiên

+ Mơi trường nuôi cấy: MS + 30g/l đường saccharose + 100ml/l

nước dừa + 100mg/l myo inosytol + 0.1mg/l BA + 5g/l agar, pH= 5.7. Môi

trường được khử trùng ở 121ºC trong thời gian 20 phút.

+ Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ nuôi cấy 24ºC ± 2ºC, cường độ ánh

sáng 2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng – 10h tối

+ Cơng thức thí nghiệm:

 Cơng thức 1: Đối chứng (xử lý EMS 0.00%)

 Công thức 2: Xử lý EMS 0.05%

 Công thức 3: Xử lý EMS 0.10%

 Công thức 4: Xử lý EMS 0.15%

 Công thức 5: Xử lý EMS 0.20%

 Công thức 6: Xử lý EMS 0.25%

 Công thức 7: Xử lý EMS 0.30%

+ Phương pháp theo dõi : Theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần , 4

tuần sau cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ sống % =

 Tỷ lệ bật chồi (%) =

 Hệ số nhân chồi =

 Chiều cao trung bình (cm) =

 Số lá trung bình (lá)=

 Tỷ lệ mẫu biến dị (%) =



Khóa luận tốt nghiệp



20



Phùng Minh Hiền CNSH - 4A



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×