Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tải bản đầy đủ - 0trang

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



ĐẬU THỊ HIỀN



NGHIÊN CỨU THU NHẬN VI THỂ VÀ ĐÁNH GIÁ

KHẢ NĂNG MANG DNA CỦA VI THỂ TỪ TẾ BÀO

HỒNG CẦU NGƯỜI



Chuyên ngành:



Công nghệ sinh học



Mã số:



60.42.02.01



Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đức Bách



NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2016



LỜI CAM ĐOAN



Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi, các kết quả nghiên

cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày



tháng



năm 2016



Tác giả luận văn



Đậu Thị Hiền



i



LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,

đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc thầy giáo TS. Nguyễn Đức Bách đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức,

thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin được cám ơn chân thành đến các thầy cô trong Bộ môn sinh học phân tửCông nghệ sinh học ứng dụng, Bộ môn công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ

sinh học, Bộ môn bệnh cây nông dược, Khoa Nông học đã tạo điều kiện thuận lợi trong

việc sử dụng các trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy siêu ly tâm và các thiết

bị khác mà tôi đã thực hiện luận văn tại Bộ môn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ (NAFOSTED)

đã tài trợ cho đề tài nghiên cứu cơ bản mã số 106-YS.06-2013.16 để tơi có điều kiện

thuận lợi thực hiện luận văn này.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày



tháng



năm 2016



Tác giả luận văn



Đậu Thị Hiền



ii



MỤC LỤC



Lời cam đoan ..................................................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii

Mục lục ........................................................................................................................... iii

Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi

Danh mục bảng ............................................................................................................... vii

Danh mục hình ............................................................................................................... viii

Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix

Thesis abstract ................................................................................................................. xi

Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 0

1.1



Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1



1.2



Giả thuyết khoa học ............................................................................................ 1



1.3



Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2



1.3.1



Mục tiêu chung: .................................................................................................. 2



1.3.2



Mục tiêu cụ thể: .................................................................................................. 2



1.4



Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2



1.4.1



Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 2



1.4.2



Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2



1.4.3



Thời gian, địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 2



1.5



Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn của đề tài ............................. 3



Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4

2.1



Tổng quan về vi thể ............................................................................................ 4



2.2.1



Giới thiệu về vi thể ............................................................................................. 4



2.2.2



Đặc điểm của vi thể ............................................................................................ 5



2.2.3



Vi thể và khả năng tương tác giữa các tế bào ..................................................... 7



2.2.4



Khả năng vận chuyển protein của vi thể............................................................. 9



2.2.5



Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể ................................................... 10



2.2



Quá trình hình thành vi thể ở tế bào ................................................................. 10



2.3.



Chức năng của vi thể ........................................................................................ 12



2.4.



Các nghiên cứu về vi thể hiện nay .................................................................... 13



iii



2.4.1.



Vi thể tham gia vào q trình đơng máu .......................................................... 13



2.4.2.



Vi thể và ung thư .............................................................................................. 13



Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 14

3.1.



Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 14



3.2.



Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 14



3.3.



Đối tượng vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 14



3.3.1



Mẫu máu ........................................................................................................... 14



3.3.2



Hóa chất ............................................................................................................ 14



3.3.3.



Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 16



3.4.



Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 18



3.5.



Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 19



3.5.1



Chuẩn bị mẫu hồng cầu .................................................................................... 19



3.5.2



Đánh giá sự hình thành vi thể theo thời gian bảo quản .................................... 19



3.5.3



Cảm ứng hình thành vi thể................................................................................ 19



3.5.4.



Xác định sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu.............................................. 19



3.5.5.



Phương pháp thu nhận vi thể ............................................................................ 20



3.5.6.



Xác định các đặc điểm của vi thể ..................................................................... 22



3.5.7.



Xác định khả năng tương tác của vi thể với DNA ........................................... 22



Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 23

4.1



Ảnh hưởng của thời gian lên sự hình thành vi thể ............................................ 23



4.2



Cảm ứng hình thành vi thể................................................................................ 25



4.2.1



Quá trình cảm ứng ............................................................................................ 25



4.2.2



Phân tích hình thái hình thái và kích thước tế bào cảm ứng ............................. 30



4.2.3



Phân tích bằng máy đếm tế bào ........................................................................ 31



4.3



Thu nhận và xác định các đặc điểm của vi thể ................................................. 32



4.3.1



Thu nhận vi thể ................................................................................................. 32



4.3.2



Phân tích vi thể bằng máy đếm tế bào .............................................................. 32



4.3.3



Phân tích kích thước vi thể bằng máy Nanosizer ............................................. 33



4.3.4



Phân tích điện tích vi thể bằng máy nanosizer ................................................. 35



4.4



Nghiên cứu tương tác giữa dna với vi thể ........................................................ 36



4.4.1



Ảnh hưởng của sốc nhiệt .................................................................................. 36



4.4.2



Ảnh hưởng của xung điện................................................................................. 37



iv



Phần 5. Kết luận và kiến nghị..................................................................................... 39

5.1.



Kết luận............................................................................................................. 39



5.2.



Kiến nghị .......................................................................................................... 39



Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 40



v



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT



Chữ viết tắt



Nghĩa tiếng Việt



A23187



Calcium Ionophore



Cai2+



Ca2+ nội bào



DMSO



Dimethyl sulfoxide



EVs



Extracellular vesicles



HEPES



4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid



LPA



Lysophosphatidic acid



MV



Vi thể (microvesicle)



PKC



Protein kinase C



PMA



Phorbol myristate acetate



PS



Phosphatydilserine



TFs



Các yếu tố mô (Tissue Factors)



vi



DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các loại tế bào hình thành từ Evs ..................................................................... 7



vii



DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào ....................................................5

Hình 2.2. Con đường hình thành vi thể. ................................................................................6

Hình 2.3. Cơ chế tương tác giữa MV với tế bào ..................................................................9

Hình 2.4. Cơ chế hình thành vi thể ......................................................................................11

Hình 2.5. Cơ chế tương tác và truyền tín hiệu của vi thể với tế bào đích .......................12

Hình 3.1. Phân tử calcium ionophore (A23187) ................................................................14

Hình 3.2. Phân tử phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ..............................................15

Hình 3.3. Phân tử lysophosphatidic acid .............................................................................15

Hình 3.4. Phân tử Annexin V-FITC.....................................................................................16

Hình 3.5. Máy siêu ly tâm .....................................................................................................16

Hình 3.6. Máy nanosizer .......................................................................................................17

Hình 3.7. Kính hiển vi thường ..............................................................................................18

Hình 3.8. Kính hiển vi huỳnh quang....................................................................................18

Hình 3.9. Quy trình thu nhận vi thể .....................................................................................21

Hình 4.1. Thời gian ảnh hưởng lên quá trình hình thành vi thể .......................................25

Hình 4.2. Sự hình thành vi thể trên tế bào hồng cầu..........................................................27

Hình 4.3. Sự hình thành vi thể khi cảm ứng bằng PMA ...................................................30

Hình 4.4. Phân tích SEM hồng cầu khi bị kích thích và hình thành vi thể.....................31

Hình 4.5. Phân tích sự hình thành vi thể ở các tế bào cảm ứng .......................................32

Hình 4.6. Phân tích vi thể sau khi tách bằng siêu ly tâm ..................................................33

Hình 4.7. Phân tích kích thước vi thể bằng máy Nanosizer .............................................34

Hình 4.8. Ảnh hưởng của mơi trường đến thế zeta của vi thể ..........................................35

Hình 4.9. Phân tích kích thước và hình dạng của vi thể....................................................36

Hình 4.10. Ảnh hưởng của sốc nhiệt đến khả năng tương tác giữa vi thể và DNA ........37

Hình 4.11. Ảnh hưởng của xung điện đến khả năng tương tác giữa vi thể

và DNA ....................................................................................................... 39



viii



TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Đậu Thị Hiền

Tên Luận văn: “Nghiên cứu thu nhận vi thể và đánh giá khả năng mang DNA của vi

thể từ tế bào hồng cầu người”.

Ngành: Công nghệ sinh học



Mã số: 60.42.02.01



Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Các thành phần tiết có nguồn gốc từ tế bào còn gọi là extracellular vesicles

(EVs). Nhiều thuật ngữ khác nhau của Evs cho đến nay đã được sử dụng và đơi khi có

sự nhầm lẫn bao gồm exosomes, microvesicles (MV), shedding vesicles, apoptosomes

hoặc thể apoptosis (apoptosis bodies) Dựa vào nguồn gốc và kích thước mà EVs chia

thành 3 loại: exosome, vi thể (microvesicle/MV) và apotosis bodies

Trong nghiên cứu này, sự hình thành của vi thể và khả năng mang DNA của vi

thể được nghiên cứu từ các tế bào hồng cầu (RBCs). Dưới điều kiện bảo quản, việc

hình thành của vi thể từ tế bào hồng cầu đã được quan sát . Ngoài ra, theo các điều

kiện cảm ứng bởi A23187, LPA hoặc PMA sự hình thành và giải phóng vi thể đã được

nghiên cứu.

Các đặc điểm của vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu đã được nghiên cứu trong

thời gian lưu trữ hoặc ở các điều kiện cảm ứng khác nhau. Bằng cách ly tâm khác nhau

và phương pháp siêu ly tâm, hai quần thể vi thể đã được thu nhận. Phân tích số liệu

bằng nanosizer cho thấy rằng kích thước của quần thể vi thể là 205,8 ± 51,4 nm và

125,6 ± 31,4 nm. Các hình thái của vi thể cũng đã được quan sát bởi SEM.

Sự tương tác của vi thể với DNA được thực hiện bằng cách sử dụng phương

pháp sốc nhiệt và xung điện. Kết quả cho thấy phương pháp sốc nhiệt không ảnh hưởng

đến khả năng tương tác giữa MV và DNA. Tuy nhiên, trong sự hiện diện của các ion

Ca2 + và xung điện, sự tương tác của vi thể và DNA đã được nghiên cứu và quan sát. Kết

quả cho thấy rằng vi thể có thể sử dụng làm vật liệu cho việc chuyển DNA.

Mục đích nghiên cứu

Vi thể được hình thành hầu hết ở tất cả các tế bào, kể cả tế bào hồng cầu. Về

nguyên tắc, những tế bào hồng cầu người khơng có nhân hoặc vật liệu di truyền. Ngồi

ra, tế bào hồng cầu hiện nay chiếm số lượng rất lớn trong máu và không cần phải nuôi

cấy tế bào. Hơn nữa, tế bào hồng cầu có thể liên hệ với tất cả các tế bào trong cơ thể.



ix



Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng vi thể hình thành từ các tế bào đã cảm ứng, đặc

biệt từ các tế bào ung thư vi thể có khả năng mang vật liệu di truyền, các phân tử protein

và tín hiệu, và chuyển đến các loại tế bào khác. Do đó, vi thể hình thành từ hồng cầu có

thể được sử dụng như một vật liệu để chuyển DNA vào tế bào mục tiêu.

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, vi thể được thu nhận từ tế bào hồng cầu người bằng cách

nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lưu trữ lên sự hình thành vi thể và cảm ứng hình

thành vi thể bằng 4-bromo-A23187 (chứng dương), axit lysophosphatidic (LPA), hoặc

phorbol-12 Myristate-13 acetate (PMA) trong sự hiện diện của 2 mM Ca2+ dẫn đến một

sự thay đổi khối lượng tế bào và hình thái tế bào hồng cầu. Khi hồng cầu bị kích thích,

sự tiếp xúc của phosphatidylserin (PS) và sự hình thành vi thể đã được quan sát bằng

cách sử dụng Annexin V-FITC. Sự hình thành và giải phóng vi thể đã được quan sát

bằng sử dụng chất cảm ứng PMA dưới kính hiển vi huỳnh quang ngược. Bằng cách sử

dụng máy nanosizer và SEM để xác định hình dạng, đặc điểm, kích thước và điện tích

vi thể. Sử dụng phương pháp sốc nhiệt và xung điện để nghiên cứu sự tương tác của vi

thể với DNA.

Kết quả chính và kết luận

Dưới điều kiện bảo quản, hồng cầu bắt đầu hình thành vi thể từ ngày 14 ở 40C.

Khi cảm ứng hồng cầu với LPA, PMA hoặc A23187 trong sự hiện diện của 2mm Ca2+

dẫn đến việc tiếp xúc của PS ngồi màng tế bào và hình thành vi thể.

Kích thước của vi thể sau khi thu nhận trong khoảng 100 đến 1000 nm. Bằng

cách ly tâm khác nhau, hai quần thể của vi thể đã được tách ra với kích thước của 205,8

± 51,4 nm và 125,6 ± 31,4 nm.

Xung điện là một phương pháp thích hợp để thúc đẩy sự tương tác của vi thể với

DNA và được sử dụng cho các thí nghiệm chuyển DNA.

Vi thể có thể được sử dụng như một vật liệu mới để mang DNA và chuyển DNA

đến các loại tế bào khác nhau.



x



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×