Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Hình 4.2. Kết quả khuếch đại gene crtB của vi khuẩn P. ananatis

Đường chạy 1, 2: Tương ứng với sản phẩm khuếch đại gene crtB

Đường chạy L: GeneRulerTM 1 kb của Thermo Sientific

Kết quả điện di sản phẩm PCR gene crtB ở hình trên cho thấy có xuất hiện

băng sáng ở đường chạy số 1 và 2, so sánh kích thước với thang chuẩn 1 kb của

hãng Thermo Sientific cho thấy sản phẩm khuếch đại có kích thước xấp xỉ 1000

bp, tương đương với kích thước gene crtB (930 bp), đồng thời sản phẩm khuếch

đại ở các đường chạy cũng chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất. Như vậy, có thể kết

luận đã khuếch đại thành công gene crtB của vi khuẩn P. ananatis.

4.1.3. Kết quả gắn nối đoạn gene crtB vào vector tách dòng

Các sản phẩm PCR do enzyme Taq DNA polymerase tổng hợp đều có đặc

điểm là có treo thêm 1 đầu dính Adenine ở đầu 3’ của mỗi mạch. Lợi dụng đặc

điểm này các vector thương mại được thiết có thêm 1 đầu treo Thymine ở đầu 5’.

Đoạn gene crtB và vector tách dòng pLUG được gắn nối với nhau bằng enzyme

ligase sau đó biến nạp vào vi khuẩn DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi

biến nạp vi khuẩn được cấy trên môi trường thạch agar có chứa kháng sinh chọn

lọc là ampicillin, đồng thời cũng có chất chỉ thị là X-gal và IPTG. Đĩa thạch được

nuôi ở 30oC trong 15 giờ, kết quả biến nạp được thể hiện trong hình 4.3.



42



 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gene crtB và vector tách dòng.



Hình 4.3. Kết quả biến nạp vào tế bào E. coli DH5α

Kết quả biến nạp trên hình cho thấy, có nhiều khuẩn lạc phát triển trên bề

mặt thạch, trong đó có xuất hiện hai loại khuẩn lạc khác nhau là khuẩn lạc màu trắng,

khuẩn lạc màu xanh. Theo lý thuyết, khuẩn lạc xanh là khuẩn lạc của những dòng tế

bào mang vector tự đóng vòng, khuẩn lạc trắng là những dòng tế bào mang vector tái

tổ hợp. Trong phạm vi đề tài chúng tơi chọn lọc ngẫu nhiên 14 dòng khuẩn lạc trắng

và 2 khuẩn lạc xanh (đối chứng) để sàng lọc các dòng tái tổ hợp.

Kết quả sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng điện di so sánh kích thước.

Các khuẩn lạc được chọn sẽ được nuôi tăng sinh trên mơi trường LB lỏng

có kháng sinh ampicilin. Ly tâm thu cặn và tách chiết DNA plasmid. Plasmid từ

16 chủng lựa chọn được điện di để kiểm tra, kết quả được thể hiện như hình 4.4.



Hình 4.4. Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn



43



Đường chạy 1-14: tương ứng với DNA plasmid của 14 dòng nghi ngờ

Đường chạy X: tương ứng với DNA plasmid của dòng khuẩn lạc xanh

Theo lý thuyết, trong cùng một điều kiện điện di phân tử DNA có kích

thước càng lớn sẽ di chuyển chậm hơn so với phân tử có kích thước nhỏ, Vector

tái tổ hợp được gắn sản phẩm PCR nên kích thước lớn hơn vector gốc khơng

mang đoạn xen, do đó có thể điện di để sàng lọc được các dòng tái tổ hợp. Từ kết

quả trên cho thấy trong 14 dòng nghi ngờ chỉ có 4 dòng 3, 4, 8, 11 là có kích

thước cao hơn so với đường chạy của dòng khuẩn lạc xanh. Như vậy đây có thể

là các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gene crtB.

Kết quả chọn lọc các dòng pLUG-B bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn.

Tuy nhiên để khẳng định chắc chắn hơn chúng tôi tiến hành sàng lọc tiếp

các dòng: 3, 4, 8, 11 bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn. Ở hai đầu đoạn gene

crtB được chúng tơi thiết kế có vị trí nhận biết của hai enzyme cắt giới hạn là

EcoR I và KpnI. Chính vì vậy chúng tơi tiến hành cắt các dòng nghi ngờ đồng

thời với hai loại enzyme này. Kết quả được thể hiện như sau:

L



1



2



3



4



3kb

1kb



Hình 4.5. Kết quả chọn lọc các dòng bằng cắt

với enzyme EcoRI và KpnI

Đường chạy 1-4: Tương ứng sản phẩm cắt của 4 dòng 3, 4, 8, 11

Đường chạy L: GeneRulerTM 1 kb của Thermo Sientific

Kết quả cho thấy cả 4 dòng sàng lọc được thì chỉ có dòng đều xuất hiện 2

băng kích thước như dự kiến: 1 băng kích thước 3000 bp tương đương kích thước



44



vector pLUG và 1 băng kích thước 930 bp tương đương đoạn gene crtB. Như vậy

4 dòng sàng lọc được đều là vector tái tổ hợp mang đoạn gene crtB.

 Kết quả giải trình tự gene crtB trên vector tách dòng

Để kiểm tra các trình tự nucleotid trên đoạn gene crtB có đột biến vơ nghĩa

khơng chúng tơi tiến hành giải trình tự dòng crtB vừa chọn lọc được.



Hình 4.6. Kết quả giải trình tự (A) và dịch mã insilico gene crtB (B)

Kết quả cho thấy Gene crtB đã tách dòng từ vi khuẩn P. ananatis có kích

thước 930 nucleotide, ở đầu 5’ có bộ ba mã mở đầu ATG và trình tự mồi crtB-F

(in đậm), ở đầu 3’ có bộ ba mã kết thúc TAG và trình tự mồi crtB-R (in đậm).

Các vị trí KpnI và EcoRI trong thiết kế ban đầu cho mục đích gắn gene sau khi

tách dòng vào vector biểu hiện pR-iEIY được bảo tồn. Trình tự crtB được dịch

mã in silico bằng công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene được dịch

mã thành công không xuất hiện stop codon vô nghĩa, có thể sử dụng để biểu hiện

ra enzyme phytoene desaturase.

Như vậy chúng tơi đã tách dòng thành cơng đoạn gene crtB trên vector tách

dòng pLUG-B và biến nạp trong vi khuẩn E. coli DH5α



45



4.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CHỨA 5 GENE MÃ HÓA CHO

CÁC ENZYME THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP

β-carotene

Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pRiEIBY

Để thiết kế vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa cho q trình sinh tổng

hợp β-carotene chúng tơi sử dụng vector tách dòng pLUG-B (đã được chúng tơi

tách dòng) và vector biểu hiện pR-iEIY là vector biểu hiện pRSET-A đã được

gắn thành công 4 gene: idi, crtE, crtI, crtY trước đó.

Sau khi biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gene crtB và vector pR-iEIY mở

vòng được ni cấy chúng tơi thu được một số khuẩn lạc mọc trên môi trường

chứa kháng sinh chọn lọc. Chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc, tách DNA plasmid từ

các dòng này chúng tơi thu được kết quả như hình 4.7A.



A



B



Hình 4.7. Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-Ieiby (A)

Vector pRSET-iEIBY được gắn xi chiều theo lý thuyết (B)

Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pR-iEIY

Đường chạy 1-5: Các dòng plasmid nghi ngờ mang gen crtB



46



Kết quả tách chiết DNA plasmid ở hình 6A cho thấy tất cả các dòng được

chọn lọc đều có băng sáng cao hơn so với băng plasmid đối chứng pR-iEIY. Như

vậy, đây có thể là các dòng nghi ngờ mang đoạn gene crtB. Tuy nhiên để có thể

chắc chắn khẳng định chúng tơi tiếp tục sử dụng các dòng 1, 2, 3, 4, 5 để cắt

kiểm tra khả năng gắn đúng gene crtB và kết quả ở hình 4.8 cho các bước chọn

lọc tiếp theo.

 Kết quả chọn lọc dòng mang gene crtB bằng bản đồ giới hạn.

Cơ sơ: Trên đoạn gen crtB có 1 vị trí nhận biết của enzyme NcoI nằm cách vị

trí nhận biết của enzyme EcoRI 581 bp. Kết quả cắt được thể hiện trên hình 4.8.



Hình 4.8. Sản phẩm cắt vector pRSET-iEIBY với EcoRI và NcoI.

Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pR-iEYBI

Đường chạy 1-5: Sản phẩm cắt tương ứng với các dòng 1, 2, 3, 4, 5.

Đường chạy M: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM 1 kb của Thermo Sientific

Từ kết quả trên cho thấy cả 5 dòng nghi ngờ đều xuất hiện 2 băng: một

băng có kích thước 581 bp (tương đương kích thước giữa hai vị trí enzyme

EcoRI và NcoI), một băng có kích thước xấp xỉ 7279 bp (tương đương kích

thước vector pRiEIY và một phần đoạn gene crtB). Điều này cho thấy đã gắn

đúng gene crtB vào vector pRSET-iEIY và gene được gắn đúng chiều như trên



47



hình 4.7B vì nếu gắn theo chiều ngược lại thì kích thước giữa 2 vị trí cắt là

402 bp.

Như vậy có thể kết luận chúng tơi gắn thành cơng gene crtB lên vector pRiEIY và các gene gắn xuôi chiều phiên mã điều khiển bởi promoter T7 tạo vector

biểu hiện pR-iEIBY trên nền tảng vector pRSET-A. Sơ đồ vector pRSET-iEIBY

thể hiện trong hình 4.7B. Các gene idi, crtE, crtI, crtB và crtY đều có chứa vị trí

bám của ribosom, bộ ba mở đầu và bộ ba kết thúc. Các gene này được sắp xếp

dưới dạng một thiết kế polycistronic operon để đảm bảo biểu hiện đồng thời dưới

sự điều khiển của promoter T7.

4.3. KẾT QUẢ CẢM ỨNG BIỂU HIỆN 5 GENE ĐÍCH TẠO RA β-carotene

VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN BẰNG MÀU SẮC CẶN

TẾ BÀO

Với những dữ liệu thu được từ: Sàng lọc bằng kích thước vector, chọn lọc

các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn, chúng tơi có thể tạm

thời kết luận đã gắn thành cơng 5 gene mã hóa cho các enzyme xúc tác q trình

chuyển hóa β-carotene lên trên vector biểu hiện là pRSET-A. Tuy nhiên với mục

đích là thu được β-carotene, thì yêu cầu các gene nằm trên vector biểu hiện phải

hoạt động, tạo ra được các enzyme và các enzyme này phải xúc tác quá trình sinh

tổng hợp β-carotene. Chính vì vậy để kiểm tra sự hoạt động của các gene chúng

tôi tiến hành biến nạp các vector tái tổ hợp pR-iEIBY vào chủng biểu hiện E. coli

BL21 (DE3) và nuôi trong môi trường LB lỏng trong vòng 6 -12 giờ, khi OD đạt

0,4 chúng tơi tiến hành cảm ứng bằng IPTG 0,1mM và tiếp tục nuôi 12 giờ. Kết

quả đánh giá sự biểu hiện các gene được chúng tơi thể hiện như hình:



48



Hình 4.9. Kết quả biểu hiện của 5 gene idi, crtE, crtI, crtB và crtY

nằm trên vector pRSET-A trong E. coli BL21(DE3)

Chú thích: Cặn khuẩn của các dòng tế bào:

(1): E. coli BL21 (DE3) mang vector pRSET-A (đối chứng);

(2): E. coli DH5α mang vector pR-iEIBY (màu vàng);

(3): E. coli BL21 (DE3) mang vector pR-iEIBY (màu da cam – màu đặc trưng của β-carotene);



Kết quả cảm ứng biểu hiện cho thấy, Ống 1 không có sự biểu hiện màu sắc

do chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) chỉ mang plasmid gốc pRSET-A khơng có

chứa 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp βcarotene. Ống số 2 và 3 cho cặn tế bào có màu tương ứng là vàng, da cam (màu

đặc trưng của β-carotene). Mức độ biểu hiện của chủng E. coli BL21(DE3) cũng

vượt trội hơn so với chủng DH5α (dựa vào độ đậm của màu sắc). Tuy nhiên, theo

lý thuyết, sự biểu hiện các gene nằm ở vị trí đa tách dòng trên vector pRSET-A

chịu sự kiểm sốt của hệ thống T7 promoter, đòi hỏi cần phải có sự xúc tác của

enzyme T7 DNA polymerase. DH5α khơng có gene mã hóa cho enzyme T7

DNA polymerase để tương thích với T7 promoter, song kết quả chúng tôi vẫn thu

được sự biểu hiện mầu sắc ở mức độ thấp. Đây là một kết quả của hiện tượng rò

rỉ biểu hiện gene. Có một số lý do dẫn đến hiện tượng này, tuy nhiên trong

trường hợp cụ thể của chúng tôi giả thuyết được đặt ra đó là trên vector pRSETA, ngồi trình tự của T7 còn một trình tự promoter nữa đó chính là bla promoter

điều khiển hoạt động của gene kháng kháng sinh. Tuy nhiên tín hiệu kết thúc trên

gene kháng kháng sinh không đủ mạnh nên kết quả promoter này sẽ phiên mã

ln cả đoạn gene kháng amp cùng các trình tự 5 gene nằm trên vùng MCS, sau

đó đoạn mRNA này được dịch mã và tạo thành protein.



49



PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

- Tách dòng thành cơng gene crtB từ vi khuẩn P. ananatis LMG 20103 có

kích thước 930 nucleotide.

- Đã tạo thành công vector biểu hiện pR-iEIBY chứa 5 gene mã hóa cho các

enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn E. coli trên

các nền tảng vector biểu hiện pRSET-A.

- Biểu hiện thành công vector pR-iEIBY trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)

tạo màu vàng và da cam (màu đặc trưng của β-carotene).

5.2. KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục nghiên cứu chuyển các gene idi, crtI, crtE, crtB, crtY lên các hệ

vector biểu hiện khác như pET28, pQE30, pGEX.

- Biến nạp các hệ vector tái tổ hợp vào các chủng E. coli khác nhau để tìm

giải pháp tối ưu cho việc biểu hiện β-carotene trong vi khuẩn E. coli.

- Tiến hành phân tích cặn khuẩn thu được từ các hệ biểu hiện trong các

chủng biểu khác nhau bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để

đánh giá khả năng sinh tổng hợp β-carotene.



50



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Ha Thi Bich Ngoc, T. T. H. N. và Nguyễn Văn Mùi (2007).Điều tra hợp chất

carotenoid trong một số thực vật của Việt Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. (23). tr. 130-134.

2. Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Xuân Vũ, Ngô Xuân Bình và Dương Văn Cường (2012).

Tạo chủng E. coli có khả năng sản xuất lycopene Tạp chí Tạp chí Nơng nghiệp &

Phát triển nông thôn –kỳ 1 -tháng 3/2012. tr. 10-14

3. Nguyễn Thị Lý và T. T. H. V. (2010). Tách tinh dầu và carotenoid từ lá trầu (Piper

betle L.). Hội Nghị Khoa Học & Công Nghệ lần 9. Phân ban Cơng nghệ Hóa học,

Trường Đại học Bách khoa - Tp.HCM.

Tiếng Anh

4. Adetayo O. Omoni and R. E. Aluko (2005). The anti-carcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene: a review. Trends in Food Science & Technology

16(8). pp. 344-350.

5.



ANS, E. P. o. F. A. a. N. S. a. t. F. (2012). "Scientific Opinion on the re-evaluation

of mixed carotenes (E 160a (i)) and



6.



Aoki, H., N. T. Kieu, N. Kuze, K. Tomisaka and N. Van Chuyen (2002).

"Carotenoid pigments in GAC fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG)."

Biosci Biotechnol Biochem. Vol 66(11). pp. 2479-2482.



7.



Armstrong, G. A. and J. E. Hearst (1996). "Carotenoids 2: Genetics and molecular

biology of carotenoid pigment biosynthesis." Faseb j. Vol 10(2). pp. 228-237.



8. Baky, H. H. A. E. and G. S. El-Baroty. (2013). Healthy Benefit of Microalgal

Bioactive Substances. Journal of Aquatic Science. Vol 1(1). pp. 11-23.

9.



Baneyx, F. (1999). "Recombinant protein expression in Escherichia coli." Curr

Opin Biotechnol. Vol 10(5). pp. 411-421.



10. BCC (2011). The Global Market for Carotenoids.

11. Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto and M. A. Z. Coelho (2011).

Technological Aspects of β-carotene Production. Food and Bioprocess Technology

4(5). pp. 693-701.

12. Biesalski, H. K., G. R. Chichili, J. Frank, J. von Lintig and D. Nohr (2007).

"Conversion of beta-carotene to retinal pigment." Vitam Horm 75. pp. 117-130.

13. Britton, G. (1995). Structure and properties of carotenoids in relation to function.

Faseb j. Vol 9(15). pp. 1551-1558.



51



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×