Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

(a) Vector pR-iEIY



Vector pRSET-A



Hình 3.1. Cấu trúc vector biểu hiện pRSET

Bảng 3.2. Các thành phần của vector pRSET-A

Thành phần



Vai trò



Vị trí



T7 promoter



Phiên mã các đoạn gene được

chèn



20-39



6X-Histag



Hỗ trợ việc tinh sạch và phát

hiện protein mục tiêu



Gene kháng ampicillin



Chọn lọc các dòng tế bào

mang vector pRSET-A



1042-1902



F1 origin



Tổng hợp 1 chuỗi DNA đơn



456- 911



pUC origin



Điểm nhận biết vị trí khởi đầu

q trình sao chép



2047-2720



112- 129



Vector pLUG: Vector pLUG là vector tách dòng TA, có kích thước 2982

bp, được thiết kế dựa vào hoạt tính terminal transferase cuả enzyme Taq- DNA

polymerase trong phản ứng PCR: Bổ sung một nucleotide A (Adenosine) vào đầu

3’ của mạch tổng hợp trong sản phẩm khuếch đại. Vector pLUG có đầu dính là

một nucleotide T (Thymine), cho phép tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại

của phản ứng PCR do Taq- DNA polymerase tổng hợp.



28



Hình 3.2. Cấu trúc vector tách dòng

Trong cấu trúc của vector pLUG bao gồm hai hệ thống chọn lọc, cho phép

chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đích thành cơng. Hệ

thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme

phân giải kháng sinh ampicilin (Amp resistant gene), điều này đồng nghĩa với

việc các tế bào mang vector pLUG có thể sống sót và phát triển trên mơi trường

có chứa kháng sinh ampicilin. Hên thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị

màu Lac-operon, hệ thống này bao gồm gene LacZ mã hóa cho enzyme βgalactosidase và Lac-promoter cảm ứng bởi IPTG. Vị trí của gene LacZ được

thiết kế sao cho bao gồm vị trí gắn xen, thiết kế này có ý nghĩa quan trọng trong

chọn lọc, cho phép phân biệt các dòng tế bào mang vector có hoặc khơng có

đoạn xen. Với các tế bào chủ mang vector pLUG tự đóng vòng hay khơng có sự

gắn xen xảy ra, Lac-operon hoạt động bình thường. Trong mơi trường có IPTG

Lac-promoter sẽ được kích hoạt q trình phiên mã xảy ra, sau đó là quá trình

dịch mã tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng

chuyển hóa cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm

các tế bào này có màu xanh. Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon

bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β-galactosidase không được

tổng hợp, khơng có sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu

trắng. Các khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc mong muốn trong chọn lọc

dòng.



29



Vector pLUG-Y: Vector tách dòng pLUG chứa gene crtY (1161 bp) mã

hóa cho enzyme lycopene cyclase xúc tác cho quá trình chuyển hóa lycopene

thành β-carotene đã được tách dòng thành cơng trước đó.

3.1.3. Hóa chất

Mơi trường ni vi khuẩn E. coli: Môi trường LB

- LB lỏng: thành phần cho 1 lít mơi trường bao gồm

+ Tryptone: 10 g

+ Yeast extract: 5 g

+ NaCl: 10 g

+ Nước khử ion: 1 lít

- LB đặc: thành phần cho 500 ml môi trường bao gồm

+ Tryptone: 5 g

+ Yeast extract: 2,5 g

+ NaCl: 5 g

+ Agar: 7 g

+ Nước khử ion: 500 ml

Hóa chất tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli

Tách chiết DNA plasmid theo phương pháp sử dụng SDS-kiềm.

Solution I:

+ Tris HCl 1M pH8

+ EDTA 0,5M pH8

+ Glucose 1M

+ Nước khử ion 100 ml

Solution II:

+ NaOH 3M

+ SDS 10%

+ Nước khử ion 200 ml

- Solution III:

+ CH3COOK 3M



30



+ CH3COOH

+ Nước khử ion 100 ml

Hóa chất dùng cho điện di DNA trong gel agarose

- Agarose

- Dung dịch dệm TAE:

+ Tris base

+ EDTA

+ NaOH

+ Acid acetic

- Đệm tra mẫu: loading dye 6X

- Ethidium bromide

Hóa chất dùng cho phản ứng thu nhận DNA từ gel agarose

- Các hóa chất đi kèm bộ Kit thu nhận DNA từ gel: GeneJET Gel

Extraction Kit của hãng Thermo Scientific.

Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào E. coli khả biến

- CaCl2 0.1M

- Glycerol

Hóa chất dùng cho biến nạp và chọn lọc khuẩn lạc

- Kháng sinh ampicilin

- LB đặc

3.1.4. Dụng cụ

Pipet, ống eppendorf 1.5 ml. đầu tip, ống fancol, đĩa petri, ống nghiệm, que

cấy, đèn cồn, giấy bạc,…

3.1.5. Thiết bị



31



Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài

STT



Tên thiết bị



Nguồn gốc xuất sứ



1



Bộ điện di



Scie – plas Ltd – UK



2



Bể ổn nhiệt



Techne – OSI



3



Cân điện tử



TE 214S – Startorius Germany



4



Máy cất nước



Canada Bio Water system –Pall Co.UK



5



Máy chụp gel



Gel Logic 1500 – Kodak - USD



6



Máy đo Ph



F – 51 BW – Horiba – Japan



7



Máy lắc



S3000 – Jeotech- Korea



8



Máy ly tâm



Eppendorf – CHLB Đức



9



Máy PCR



Amplied Biosystems USA/Singapore



10



Máy spindown



E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA



11



Máy Vortex



Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China



12



Nồi hấp khử trùng



HV – 110 – Hirayama – Japan



13



Tủ an toàn sinh học cấp 2



Nu – 425 – 400E – Nuaire - USA



14



Tủ lạnh -20oC, -80oC



Super freezer Eco 130 – Ficchetti - Italy



3.1.6. Phạm vi nghiên cứu

- Tách dòng gene crtB mã hóa cho enzyme phytoene desaturase từ vi khuẩn

Pantoea ananatis.

- Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho các enzyme tham gia

vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene.

- Cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá sơ bộ mức

độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào.

3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Địa điểm: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene – Viện Khoa học

sự sống – Đại học Thái Nguyên – Tổ 10 – Xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên.

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2016 đến tháng 09/2016.



32



3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Tách dòng gene crtB mã hóa cho enzyme phytoene desaturase

từ vi khuẩn Pantoea ananatis.

+ Tách DNA tổng số của vi khuẩn P. ananatis.

+ Khuếch đại đoạn gene crtB bằng cặp mồi đặc hiệu.

+ Gắn nối vào vector tách dòng pLUG tạo vector tái tổ hợp pLUG-B

+ Sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp điện di so sánh kích

thước.

+ Chọn lọc các dòng tái tổ hợp mang đoạn gene crtB bằng phương pháp lập

bản đồ giới hạn.

+ Giải trình tự và so sánh với ngân hàng dữ liệu

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho các enzyme

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene.

+ Cắt vector pLUG-B và vector pR-iEIY bằng hai enzyme giới hạn EcoRI

và KpnI.

+ Tinh sạch sản phẩm cắt bằng phương pháp thôi gel.

+ Gắn nối gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-IEIBY

+ Biến nạp sản phẩn gắn nối vào vi khuẩn E. coli DH5α.

+ Sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng điện di so sánh kích thước: Tách chiết

DNA plasmid theo phương pháp sử dụng SDS-kiềm.

+ Kiểm tra sự có mặt của gen crtB trong vector biểu hiện bằng các phản

ứng cắt với EcoRI và NcoI.

Nội dung 3: Cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá

sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào

+ Biến nạp vector tái tổ hợp mang 5 gene mã hóa cho các enzyme tham gia

vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene vào E. coli BL21 (DE3).

+ Cảm ứng biểu hiện

+ Đánh giá cảm quan khả năng sinh tổng hợp β-carotene bằng màu sắc cặn

khuẩn.



33



3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU



(E.co RI và Kpn I)



(E.co RI và Kpn I)



3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

- Bổ sung 500 µl dung dịch CTAB, đảo trộn đều bằng máy vortex sao cho

tan đều mẫu trong dung dịch đệm ủ ở tủ sấy 95oC trong 5 phút, lấy ống cho vào ủ

ở tủ -20oC trong 5 phút, làm lặp lại 3 lần.

- Đảo trộn đều bằng máy vortex sau đó cho vào bể ổn nhiệt 60oC trong 1

giờ, cứ 10 phút lấy ra vortex 1 lần.

- Sau 1 giờ, lấy ống eppendorf chứa mẫu ra, bổ sung 600 µl CIAA, mix đảo

trộn đều bằng pipet hoặc vortex cho tan đều.

- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút

- Nhẹ nhàng đặt mẫu vào giá để ống eppendorf. Dùng micropipette 200 µl

hút nhẹ nhàng dịch pha trên khoảng 600 µl vào ống eppendorf 1,5 ml mới. Chú ý

không được hút phần cặn tế bào ở pha giữa, tốt nhất là khơng nên hút tồn bộ

dịch pha trên. Ở bước này có thể bổ sung CIAA thêm 1 lần nữa để loại bỏ hồn

tồn các sản phẩm phụ khơng mong muốn.

- Bổ sung vào ống eppendorf 50 µl CH3COOK và 650 µl isopropanol.

Dùng micropipette 200 µl đảo trộn nhẹ nhàng toàn bộ dung dịch bên trong ống

eppendorf.



34



- Ly tâm nhẹ để khối dung dịch lắng xuống phía dưới ống eppendorf.

- Đặt ống eppendorf chứa mẫu vào tủ -20oC trong 1- 2 giờ.

- Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút.

- Loại bỏ dịch nổi thu cặn, hút bỏ dịch nhẹ nhàng tránh khơng làm

bong cặn.

- Bổ sung 1.000 µl cồn 70% lạnh rồi đảo trộn mạnh bằng máy vortex hoặc

bằng pipet sao cho phần cặn long ra khỏi đáy ống.

- Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch nổi thu cặn, có thể

bổ sung cồn để rửa lần hai. Sau đó, dùng micropipette hút loại bỏ hồn tồn

dịch cồn còn sót lại trong ống. Ly tâm ống 10.000 vòng/ phút trong 1 phút, loại

bỏ dịch còn sót.

- Mở nắp ống eppendorf để khô tự nhiên cho đến khi trong ống eppendorf

khơ hồn tồn (khoảng 10 -15 phút).

- Bổ sung vào ống eppendorf chứa kết tủa DNA 50 µl dung dịch TE 1x,

mix đều bằng pipet. Có thể bổ sung 2 µl RNase vào và ủ ở bể ổn nhiệt 37oC

trong 10 phút.

- Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose 1%. Bảo quản DNA

tách chiết trong tủ lạnh -20oC.

3.4.2. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR khuếch đại gene crtB với cặp mồi đặc hiệu được thực hiện với

tổng thể tích 15 µl chạy 25 chu kì. Thành phần phản ứng được trình bày theo bảng:

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR

HĨA CHẤT



THỂ TÍCH(µl)



DNA khn



2



PCR Master mix



7,5



Mồi



1,5



dH2O



4



Tổng thể tích



15



Trộn đều hỗn hợp sau đó spindown và chuyển vào máy PCR, tối ưu hóa

nhiệt độ gắn mồi ở 53oC trong 30 giây. Chạy phản ứng với chu trình nhiệt xác

định với khoảng 35 chu kì. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel



35



agarose 1%. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.



Hình 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

3.4.3. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose

Phương pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại

phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với điện thế và

cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường.

Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình của

DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước

nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dương nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn.

Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương

pháp so sánh kích thước.

Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:

Chuẩn bị gel

+ Cân 1 gam agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun sơi trong lò

vi sóng sao cho agarose tan hồn tồn.

+ Để gel nguội đến 60oC, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lược và đợi cho gel

đông lại.

+ Nhấc lược khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.

+ Đổ dung dịch đệm TAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.

Tra mẫu điện di

+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 1 µl loading dye với 5 µl mẫu.

+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 80-110 V, 100 mA, trong 35

phút (khi vị trí vạch mầu chạy được khoảng 2/3 bản gel).



36



Nhuộm gel

+ Bản gel được lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide

(nồng độ 30 µl/l) trong 15 phút.

+ Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.

3.4.4. Phương pháp lập bản đồ giới hạn

Bản đồ giới hạn là các vị trí enzyme giới hạn đã biết có trong trình tự đoạn

DNA phân lập. Lập bản đồ giới hạn là phương pháp yêu cầu sử dụng enzyme cắt

giới hạn.

Thông thường phương pháp lập bản đồ giới hạn nhằm kiểm tra xem DNA

plasmid vừa tách chiết có mang đoạn chèn hay không, sau phản ứng cắt được xử

lý để kiểm tra bằng điện di trong gel agarose. Phương pháp cắt với enzyme giới

hạn cũng được dùng để xử lý đoạn gene và vector để tạo đầu so le, thuận lợi cho

việc gắn gene vào vector. Ngoài ra, còn được để kiểm tra chiều gắn của gene dựa

trên việc tính tốn các vị trí enzyme giới hạn. Trong đề tài, sử dụng một số

enzyme cắt giới hạn để tạo đầu sole: EcoRI, KpnI, NcoI. Tùy từng mục đích mà

thực hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn với thành phần khác nhau.

3.4.5. Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose

Các vector biểu hiện và vector tách dòng sau khi được xử lý bằng enzyme

giới hạn với mục đích mở vòng vector và thu đoạn gel, sau đó được chúng tôi

tiến hành tinh sạch sản phẩm cắt bằng phương pháp thu nhận DNA từ gel

agarose.

Quy trình làm theo hướng dẫn của bộ Kit “GeneJET Gel Extraction Kit”

của hãng Thermo Scientific.

+ Cân và ghi lại khối lượng ống eppendorf 1.5 ml.

+ Cắt gel: Đưa bản gel đã nhuộn lên máy soi gel, bật UV, xác định vị trí

chứa DNA đích, cắt nhanh chóng và cho vào ống eppendorf. (chú ý: thao tác

nhanh tránh để UV làm hỏng DNA).

+ Cân lại ống eppendorf sau khi đã cho gel, ghi lại khối lượng từ đó suy ra

khối lượng gel.

+ Bổ sung đệm ly giải gel agarose (Bindding buffer) vào ống eppendorf

theo tỷ lệ 1:1 (1 gam tương đương 1000 µl).

+ Ủ ở 55oC cho đến khi gel tan hoàn toàn.



37



+ Hút dịch sang cột lọc, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dung

dịch dưới cột.

+ Bổ sung 700 µl đệm rửa (washing buffer), ly tâm 10.000 vòng/phút trong

1 phút, loại bỏ dịch lỏng.

+ Ly tâm lần 2 ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hết ethanol thừa.

+ Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 25 µl đệm đẩy (elution

buffer), sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút.

+ Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel.

3.4.6. Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện

Gắn sản phẩm thôi gel bằng enzyme T4 DNA ligase.

Bảng 3.5. Thành phần phản ứng gắn nối

Thành phần



Thể tích (µl)



Vector



5



Đoạn xen



5



10x buffer T4



3



T4 DNA ligase



1



H20



16



Tổng



30



+ Ủ ở 22oC trong 1giờ

3.4.7. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến

Để nhân dòng hay biểu hiện vector trong tế bào, thì tế bào đó phải được xử

lý để làm biến đổi cấu trúc màng nhằm tạo điều kiện cho sự khuếch tán DNA

plasmid ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp tạo tế bào khả biến phổ

biến, đơn giản thường là sử dụng CaCl2. Sau đây là quy trình tạo tế bào khả biến.

+ Chủng E. coli được nuôi qua đêm trên mơi trường LB ở máy lắc 37oC,

200 vòng/phút;

+ Lấy 1ml dịch nuôi cấy vào 100ml môi trường LB lỏng, tiếp tục ni lắc

1,5 giờ ở 37oC, 200 vòng/phút. Đến khi OD600 đạt 0,4 – 0,6;

+ Đặt trong đá khoảng 10 phút;



38



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×