Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tải bản đầy đủ - 0trang

Đồ án tốt nghiệp



- Enzyme:

Sử dụng enzyme Cenllulase:

Tên thương mại: Cellusoft L.

Đặc tính: sản xuất từ chủng Trichoderma viridae. Hoạt tính chính cellulase.

Điều kiện hoạt động tối ưu: nhiệt độ 50-550C, pH: 4,5-5,5

[http://bakteri-enzim.com/a_cellusoft_L_e.html]

2.2.3. Hóa chất

– Các hóa chất dùng trong vi sinh: glucose, saccharose, agar, NaNO3, K2HPO4,

MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2.2H2O, CuSO4.5H2O, KNO3,

(NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, NH4NO3, xanh methylene, Tween 80…

– Các hóa chất dùng trong xác định thành phần sinh hóa: HNO3đđ, H2O2,

CH3COOHđđ, HCl, NaOH, CaCl2, AgNO3, H2SO4, H3BO3, cồn 96o, ete etylic,

hexan…

2.2.4. Dụng cụ

- Pipette 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.

- Ống nghiệm.

- Cốc thủy tinh 100 ml, cốc 250 ml, cốc 500 ml, cốc 1000 ml.

- Bình định mức 100 ml.

- Máy đo pH Thermo.

- Cân phân tích (Precisa).

- Cân kỹ thuật.

- Máy đơng khơ.

- Bếp đun.

- Tủ sấy.

- Đũa khuấy, ống đong, giấy lọc, phễu.



40



Đồ án tốt nghiệp



2.2.5. Thiết bị

- Máy đo pH Thermo.

- Cân phân tích TE 313 Satorius

- Tủ sấy Sanyo (Nhật)

- Buồng đếm hồng cầu Thomas (Đức)

- Bể ủ nhiệt Memmert (Đức)

2.2.6. Môi trường

2.2.6.1. Môi trường giữ giống PGA

Môi trường dùng để giữ giống: PGA (potato glucose agar) (Trần Linh Thước,

2003)

Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong môi trường PGA



THÀNH PHẦN PGA



HÀM LƯỢNG



Khoai tây



200g



Glucose



20g



Agar



20g



pH môi trường



6,5



Nước cất



1000ml



Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát được nấu với nước cất trong khoảng 30

phút, sau đó lọc chiết lấy nước. Cho agar vào và tiếp tục nấu, trong quá trình nấu phải

khuấy đều, cuối cùng cho glucose vào và khuấy cho tan hết.

Cho môi trường vào 1/4 các ống nghiệm, khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút,

sau đó xếp nghiêng các ống nghiệm, để nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Mặt thạch

không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm.

Dùng que cấy móc đã khử trùng, cấy truyền từ ống giống sang các ống nghiệm

được chuẩn bị ở trên. Sau 2 ngày ở nhiệt độ phòng, bào tử nấm phát triển và mọc đều,



41



Đồ án tốt nghiệp



các ống nghiệm giữ giống sẽ được bảo quan trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 9oC để sử

dụng cho các thí nghiệm về sau. Tất cả các thao tác trên đều được thực hiện trong điều

kiện vô trùng.

2.2.6.2. Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khống cho mơi trường lên men bán

rắn).

Bảng 2.2 Thành phần các chất trong môi trường Czapek

Hàm lượng



Thành phần

NaNO3



3,5 g



K2HPO4



1,5 g



(NH4)2SO4



30 g



MgSO4.7H2O



0,5 g



KCl



0,5 g



FeSO4



0,01 g



Saccaroza



30g



Nước



1000 ml



2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp cấy chuyền giữ giống, nhân giống và thu sinh khối nấm mốc

Trichoderma koningii trên môi trường lên men bán rắn. [Nguyễn Tiến Thắng và

các tác giả (2006), Thực tập Công nghệ protein & enzyme, Viện Sinh học

Nhiệt đới, Tp.HCM, tr. 23-27.]

– Phương pháp cấy chuyền giữ giống.

+ Mơi trường ni cấy PGA được pha chế và rót vào 1/3 ống nghiệm, hấp

khử trùng ở 121oC/15 phút, lấy ra và để nghiêng cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử

dụng que cấy móc đã khử trùng cấy chuyền theo phương pháp cấy ria trên bề mặt thạch

được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Giống sau khi cấy, ni ở nhiệt độ phòng thí

nghiệm trong thời gian khoảng 5 – 7 ngày, sau đó bảo quản ở 4 – 8oC. Sau thời gian



42



Đồ án tốt nghiệp



khoảng 2 tháng, cấy chuyền giữ giống một lần để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi

sinh vật.

– Phương pháp nhân giống nấm mốc.

+ Nhân giống trên mơi trường lúa: mục đích tạo giống tốt hơn, bảo quản

được lâu hơn và chuẩn bị giống, đảm bảo lượng giống cho việc nuôi cấy trên môi

trường lên men bán rắn.

+ Lúa rửa sạch, để ráo. Cân 10 g cho vào một bình erlen 250 ml. Bổ sung

thêm 10 ml dung dịch khoáng dinh dưỡng Czapeck vào trộn đều, hấp khử trùng

ở 121oC/15 phút, để nguội.

+ Lấy 5 ml dung dịch nước muối sinh lý chứa Tween 80 0,1% đã được khử

trùng cho vào ống giống, dùng que cấy đã khử trùng mài nhẹ trên mặt thạch để tách

bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm trong pha nước như các dịch huyền phù. Sau đó đổ

tồn bộ nước chứa dịch huyền phù bào tử vào môi trường nhân giống và trộn kỹ để cho

các bào tử phân phối đều trong tồn bộ mơi trường nhân giống, đậy nút bơng, bao gói.

Ni trong điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 – 5 ngày ni cấy, bào tử nấm mốc đã mọc

phủ kín các hạt lúa thì mang bảo quản ở 4 – 8oC.

– Phương pháp thu sinh khối nấm mốc Trichoderma sp.

+ Cho 20 ml nước muối sinh lý chứa Tween 80 0,1% vơ trùng vào bình môi

trường lúa. Dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy cho các bào tử nấm mốc lẫn vào trong

nước cất. Dùng pipetman hút một lượng thể tích (ml) dịch huyền phù bào tử nhất định

sau khi đã khảo sát cho vào mơi trường bán rắn. Ni ủ ở nhiệt độ phòng.

2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê Duy Linh

và cộng sự, 1997)

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm VSV có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm

mốc). Các loại buồng đếm hồng cầu thường được sử dụng: buồng đếm Thomas và

buồng đếm Goriep.



43



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×