Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Tải bản đầy đủ - 0trang

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu

nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai

chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả

cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR

(phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( 1H

và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được

biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.

Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học của các proton

được xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá

học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy

chúng được biểu diễn bằng một độ chuyển dịch hoá học khác nhau. Dựa vào độ

chuyển dịch hố học, diện tích pic cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ

với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.

Phổ



13



C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử



carbon ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo

cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với

phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).

Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc carbon khác

nhau. Trên phổ DEPT 135 khơng cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH

và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ

DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ

DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4.



13



C-NMR và phổ



CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân và lá của cây Trứng quốc (Stixis suaveolens

(Roxb.) Pierre) được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam. Mẫu

được thu hái vào tháng 3 năm 2017 tại Phú Lương, Thái Nguyên và được giám

định bởi PGS.TS. Trần Văn Ơn, Trường Đại học Dược Hà Nội,và lưu tiêu bản

tại Trung tâm nghiên cứu xuất sắc liên ngành nghiên cứu về lĩnh vực các HCTN

giữa Việt Anh – Anh Quốc – Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Cơng

nghệ Việt Nam.



Hình 2.1. Hình ảnh tiêu bản của cây Trứng quốc

2.1.2. Hóa chất

- Các dung môi: n-hexane,dichloromethane, ethylacetate, acetone, methanol.

- Sắc ký lớp mỏng (TCL) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica

gel60 Merck F254 cỡ hạt 0,063-0,2 mm,… . Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử

ngoạiở 2 bước sóng λ= 254 nm và 365 nm.

- Sắc ký cột (CC) sử dụng Silica gel Merck cỡ hạt 40-60 µm.

- Sắc ký cột (CC) với pha tĩnh là Sephadex LH-20.



- Thuốc thử Ce(SO4)2.

2.1.3. Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm:

- Dụng cụ thí nghiệm

- Bình tam giác (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml.....).

- Bình cầu (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.......).

- Ống nghiệm.

- Bình đựng dung mơi (500 ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít).

- Bình ngâm chiết ngun liệu (50 lít).

- Bình thủy tinh (25 ml, 50 ml, 100 ml....).

- Ống đong ( 5 ml, 10 ml, 50 ml, 250 ml,…).

- Các loại phễu chiết, pipet, ống hút chia độ.

- Các thiết bị

- Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 210

- Cột sắc kí  45 mm

- Bản sắc ký lớp mỏng silicagel Merck 60 F254 dày 0,2 mm

- Bình triển khai bản mỏng

- Tủ sấy, máy sấy

- Máy hiện UV

- Tủ hút

- Bơm hút chân không

- Cân kỹ thuật

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance AM500FT-NMR

- Máy đo phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD

-Máy đo phổ hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS

2.2. Nội dung nghiên cứu

1. Thu thập mẫu lớn cây Trứng quốc (Stixis Suaveolens (Roxb) Pierre) để

tiến hành nghiên cứu.



2. Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ bằng các phương pháp hóa lí

hiện đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại IR; phổ khối

lượng MS .

2.3.Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật.

Cân 3,0 kg cây trứng quốc được xay nhỏ. Ngâm ngập trong metanol 60 0

trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó tiến hành lọc thu lấy dịch chiết (tiến hành

03 lần ) đem quay cất thu được cặn MeOH tổng. Cặn MeOH tổng được phân bố

lại trong hỗn hợp nước, sau đó chiết với dung mơi n-hexan/3 lần, thu phần dịch

n-hexan để cất loại dung môi thu được cặn n-hexan TQH (15g) và dịch nước còn

lại. Tiếp theo, dịch nước còn lại được chiết với diclometan 3 lần, thu lấy phần

dịch diclometan, cất loại dung môi thu được cặn diclometan TQD (9 g). Tiếp

theo, dịch nước còn lại được chiết với ethyl acetat 3 lần, thu lấy phần dịch

etylacetat, cất loại dung môi thu được cặn etyl acetat TQE (11 g). Từ dịch nước

còn lại quay cất thu được (50g)

Bảng 2.1. Hiệu suất chiết các phần chiết

STT



Phần chiết



Khối lượng (g)



Hiệu suất (%)



1



n-Hexan (TQH)



15



0,5



2



Diclometan (TQD)



9



0,3



3



Etyl axetat (TQE)



11



0,367



4



Cặn nước



50



Quá trình ngâm chiết cây Trứng quốc được trình bày trong Sơ đồ 1

Cây Trứng quốc (TQ)

(3kg)

- Chiết methanol 72h x 3

lần

- Cô quay



Dịch chiết Methanol

TQ

- Cô quay

loại dung



Dịch chiết TQ



Dịch chiết n-hexan TQ

- Chiết diclomethan

24hx3 lần



Cặn chiết n-hexan

TQH (15g)

Dịch chiết TQ



Dịch chiết diclomethan TQ

Cô quay loại

dung mơi



Chiết



etylacetat

- 24hx3 lần



Dịch nước còn lại



Cặn chiết

diclomethan TQD

(9g)



Dịch chiết etyl acetat

TQE

Cô quay

loại dung môi



Cặn chiết etyl acetat

(TQE 11g)

Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết mẫu cây Trứng Quốc.



2.3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên

Từ11g cặn chiết ethyl axetate, lấy ra khoảng vài mg cho vào ống nghiệm,

đem hòa tan bằng dichloromethane. Tiến hành chấm khảo sát bằng sắc kí lớp

mỏng với các hệ dung mơi. Cuối cùng, ta lựa chọn hệ dung môi

dicholromethane

– methanol cho quá trình rửa giải.

Cặn chiết ethyl axetate được hòa tan trong dung mơi dichloromethane rồi

bổ sung 45g silicagel. Tiếp đó, đem cô quay thu được cặn bột để chạy cột.

 Các thông số chạy cột:

 Lượng chất: 11 g.

 Lượng silica gel dùng tẩm: 29g silicagel.

 Lượng silica gel dùng chạy cột: 300g (kích thước hạt silicalgel 0.040.63 mm)

 Đường kính cột: 70 mm, chiều cao cột: 300 mm.

 Thể tích mỗi lần hứng: 100ml

Quá trình chạy cột được thực hiện với hệ dung môi dichloromethane –

methanol với gradient nồng độ thay thay đổi từ 100 – 0 đến 0 – 100.

Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC) với các

hệdung mơi thích hợp. Các ống nghiệm hiện vết giống nhau trên sắc ký lớp

mỏng được gom lại thành phân đoạn lớn, cô quay loại dung mơi thu được 20

phân đoạn chính.



Hệ dung mơi



Thể tích (ml)



Dichloromethane -



Dichloromethane -



Methanol



Methanol



100 : 0



1500 – 0



Phân

đoạn



Ống hứng



TCE.1



12



TCE.2



35



TCE.3



69



TCE.4



11  17



100 : 1



1200 – 12



TCE.5



18  23



90 : 1



450 – 5



TCE.6



24  34



80 : 1



800 – 10



70 : 1



700 – 10



TCE.7



35  46



50 : 1



1000 – 20



TCE.8



47  52



40 : 1



800 – 20



TCE.9



53  61



TCE.10



62  73



TCE.11



74  78



TCE.12



79  86



30 : 1



2250 – 75



25 : 1



1500 – 60



TCE.13



87  91



20 : 1



600 – 30



TCE.14



92  101



15 : 1



1350 – 90



TCE.15



102  107



TCE.16



108  112



TCE.17



113  119



TCE.18



120  125



TCE.19



126  137



TCE.20



138  150



10 : 1



2400 – 240



5:1



500 – 100



0 : 100



0 – 500



2.3.3. Phân lập phân đoạn TCE.3 (ống 6  9)

Từ phân đoạn 3 khảo sát sắc ký lớp mỏng và tiến hành chạy cột tinh với hệ

dung môi n – hexane và ethyl axetate.



Các thông số chạy cột:

Lượng chất: 156 mg.

Lượng silica gel dùng chạy cột: 30g. Kích thước hạt 0.04 – 0.063 mm.

Đường kính cột: 20 mm, chiều cao cột: 600 mm.

Tiến hành chạy cột:

Chuẩn bị chất chạy cột: Lấy 156 mg cặn hòa tan hồn tồn bằng

dichloromethane và tẩm với 260 mg silicagel kích thước 0.04 – 0.063 mm. Cô

quay chân không loại dung môi đến khô.

Chuẩn bị cột: Chọn cột có đường kính 25 mm, dài 600 mm, có van khóa.

Rửa sạch, tráng cột bằng acetone và sấy khơ. Lót dưới đáy cột một ít bơng.

Chuẩn bị silicagel nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt: Cân khoảng 30g

silicagel cỡ hạt 0.04-0,063 mm. Hoạt hóa lượng silicagel trên bằng cách sấy ở 110

– 120°C trong 1 – 2 giờ. Ngâm silicagel đã hoạt hóa đến trương nở hồn tồn

trong n - hexane. Trong q trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để

đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều.

Nhồi cột: Dựng cột thẳng đứng. Rót từ từ hỗn dịch silicagel vào cột, vừa

rót vừa gõ nhẹ để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều. Mở van khóa cho dung mơi



chảy và silicagel sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Khi dung môi chảy gần hết

trong cột thì tiếp tục rót hỗn dịch silicagel vào cột. Lặp lại đến khi đổ hết hỗn

dịch silicagel vào cột. Lượng dung môi hứng được lại tiếp tục được đổ lên cột và

cho chảy liên tục. Chạy ổn định cột một thời gian trước khi đưa chất lên cột. Khi

dung môi cách bề mặt chất hấp phụ 1 – 2 cm, khóa van, gõ cho phẳng bề mặt

cột. Rải chất đã được tẩm silicagel thành một lớp đều đặn trên mặt cột.

Chạy cột: Tiến hành rửa giải bằng hệ dung mơi n-hexane – ethyl axetate.

Q trình chạy cột được thể hiện trong bảng sau:

Hệ dung mơi



Thể tích



n-hexane – ethyl



n-hexane – ethyl



axetate



axetate



Phân đoạn



13

25 : 1



500 – 20



49

10  16

17  19

20  23

24  38



15 : 1



300 – 20



39  42

43  47



10 : 1



300 – 30



48  51

52  60



Trong quá trình chạy cột tiến hành khảo sát sắc ký lớp mỏng thu được 10

phân đoạn như bảng trên.

Phân đoạn TCE.3.4 có khối lượng 37mg, khảo sát trên sắc kí bản mỏng

thấy chỉ có mơt cấu tử chính. Lượng chất này được đem sắc ký côt tinh với hệ

dung môi n-hexane - ethyl axetate = 25 : 1 (H:E = 25:1), thu được 14 mg chất

kết



tinh dạng bột vô đinh hình màu trắng, kí hiệu là TCE3a.

Phân đoạn TCE.3.8 chỉ có mơt cấu tử chính trên sắc ký bản mỏng, sắc ký

cột tinh với hệ dung môi n-hexane – ethyl axetate = 10 : 1 (H:E = 10:1) để rửa

chất màu thu được 6 mg chất sạch, kí hiệu TCE15a.

Quy trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat được trình bày ở sơ đồ 2:

11 g cặn ethyl axetate



Dichloromethane – Methanol gradient

0 ÷ 100%

100% CH2Cl2

….......

Phân

đoạn TCE.1



Phân đoạn TCE.20



Phân đoạn TCE.3 (156mg)



n-hexane – ethyl axetate = 25:1, 15:1, 10:1

…....TCE.3.1 …



TCE.3.4



- Sắc kí cột - Sắc kí cột H:E = 25:1 H:E = 30:1

TCE4a(1

4mg)



TCE.3.8



TCE.3.10



- Sắc kí cột H:E = 10:1



TCE3a(1

4mg)



TCE15a

(6mg)



Phytol



daucosterol



beta-sitosterol

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập các chất từ cặn ethyl axetate.



TCE.3B



2.4. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất phân lập được

2.4.1. Hợp chất beta-sitosterol (TCE4A)



Chất β-sitosterol: Tinh thể hình kim màu trắng, đnc. 135-136 oC.

1



H-NMR và 13C-NMR.



1



H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 0,68 (3H, s, 18-CH3), 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz,



21-CH3), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz, 26-CH3), 0,84 (3H, d, J = 6,8 Hz, 27-CH3), 0,84

(3H, t, J = 7,4 Hz, 29-CH3), 1,00 (3H, s, 19-CH3), 3,53 (1H, tt, J = 4,8 Hz, 11,0

Hz, H-3), 5,35 (1H, dd, J = 5,2 Hz, H-6).

13



C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 37,27 (C-1); 31,68 (C-2); 71,83



(C3); 42,32 (C-4); 140,77 (C-5); 121,73 (C-6); 31,93 (C-7); 31,93 (C-8); 50,17

(C-9); 36,52 (C-10); 21,10 (C-11); 39,80 (C-12); 42,35 (C-13); 56,79 (C-14);

24,31 (C-15); 28,25 (C-16); 56,09 (C-17); 11,87 (C-18); 19,40 (C-19); 36,16 (C20); 18,79 (C-21); 33,98 (C-22); 26,13 (C-23); 45,87 (C-24); 29,19 (C-25); 19,82

(C-26); 19,05 (C-27); 23,10 (C-28); 11,99 (C-29).



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×