Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Thành phần phản ứng

Thành phần phản ứng

Tải bản đầy đủ - 0trang

2. Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Sambrook J, Russel DW. (2001).

+ Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy và bổ sung 1µl EtBr rồi đổ vào

khuôn gel đã lắp sẵn lược để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel

đã nguội hoàn toàn thì rút lược và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X,

sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.

+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA),

trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử DNA lắng

xuống trong q trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel.

+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút.

+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới

ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm.

3. Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose.

Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành

tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA

Cloning Kit của hãng Invitrogen với các bước như sau:

1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn.

2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 10: 60

(mg/ µl) trong ống vơ trùng 5ml.

3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy

hết.



4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C.

5. Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc.

6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn đều rồi



ủ ở nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía

dưới.

7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5

phút.



8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột tinh sạch

sang eppendorf 1,5 ml.

9. Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

10.



Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu



hồi các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C.



Phụ lục 3: Kết quả so sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4

với các trình tự của GenBank



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Thành phần phản ứng

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×