Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Phụ lục 1: Đặc điểm các mẫu bệnh phẩm

Phụ lục 1: Đặc điểm các mẫu bệnh phẩm

Tải bản đầy đủ - 0trang

22



NĐ3



+



-



AB



+



23



NĐ4



+++



+++



ABCD



+



24



NĐ5



+++



+++



ABCD



+



25



NĐ6



-



-



AB



-



26



NĐ7



+



-



AB



+



27



NĐ8



+



-



AB



+



28



NĐ9



-



-



AB



-



29



NĐ10



+++



+++



ABCD



+



30



NĐ11



+++



+++



ABCD



+



31



KH1



-



-



AB



-



32



KH2



-



-



AB



-



33



KH3



-



-



AB



-



34



KH4



+++



++



ABCD



+



35



KH 5



+++



+++



ABCD



+



36



KH6



+



-



AB



-



37



KH7



-



-



AB



-



38



KH8



-



-



AB



-



39



KH9



+



-



AB



+



40



BT1



+



-



AB



-



41



BT2



+++



+++



ABCD



+



42



BT3



-



-



AB



+



43



BT4



+++



+++



ABCD



+



44



BT5



-



-



AB



-



45



BT6



-



-



AB



-



46



BT7



+



-



AB



+



47



BT8



-



-



AB



-



48



BT9



+++



+++



ABCD



+



49



BT10



-



-



AB



+



50



BT11



-



-



AB



-



51



BT12



+++



++



ABCD



+



Ghi chú:

A: Bỏ ăn

B: Bơi tách đàn, màu sắc cơ thể đen tối

C: Mắt lồi, bóng hơi căng, ruột chứa dịch

D: Bơi ngửa, bơi xoay tròn, có hiện tượng chết

(-): Khơng có CPE ở mơ não, mơ mắt; khơng có gen T4

(+): Có gen T4

(++): CPE > 50%

(+++): CPE > 85%

(++++): CPE > 98%, có hiện tượng tan bào



Phụ lục 2: Một số phương pháp đã sử dụng trong luận án

1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA

theo nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi cDNA,

sau đó dùng sợi này làm khn mẫu để tổng hợp sợi DNA.

Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng

Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên

mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuếch

đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết.

Để khuếch đại trình tự T4 của RNA-2 dài 421 bp của E. fuscogutatus

và E.akaara, dựa trên trình tự của GenBank chúng tôi đã thiết kế cặp mồi

gồm:

P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và

P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’)

Thành phần phản ứng

Thành phần phản ứng



Thể tích (µl)



RT-PCR buffer



10



Q- solution



10



dNTP



2



Enzyme DNA-polymerase



2

0,6



Mồi: P1-P2



5



RNA temperlate

RNase- free water



19,8



Tổng



50



Chu trình nhiệt

RT: 50ºC/ 30phút

PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút

- 94ºC/ 30s

- 60ºC/30s

- 72ºC/ 1p

- 72º C/ 5p



30 cycle



2. Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Sambrook J, Russel DW. (2001).

+ Cân 0,2 gam agarose đun nóng chảy và bổ sung 1µl EtBr rồi đổ vào

khn gel đã lắp sẵn lược để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel

đã nguội hồn tồn thì rút lược và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X,

sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel.

+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA),

trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử DNA lắng

xuống trong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel.

+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút.

+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới

ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm.

3. Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose.

Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành

tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA

Cloning Kit của hãng Invitrogen với các bước như sau:

1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn.

2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 10: 60

(mg/ µl) trong ống vơ trùng 5ml.

3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy

hết.



4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C.

5. Hút 400µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc.

6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn đều rồi



ủ ở nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía

dưới.

7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5

phút.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Phụ lục 1: Đặc điểm các mẫu bệnh phẩm

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×