Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG

- Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG

Tải bản đầy đủ - 0trang

IPTG này đến kết quả tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp, IPTG được bổ sung

vào môi trường với các nồng độ từ 1- 6 mM. Chủng E. coliBL21-pET32a+-T4

được nuôi cấy ở các điều kiện pH = 7, thời gian tăng sinh sau 4 giờ ở nhiệt độ

nuôi tăng sinh 370C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 µg/ml, nồng độ

IPTG cảm ứng là 1mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM và 6 mM. Kết quả thí

nghiệm được trình bày trong Hình 3.23.



Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến mức độ biểu hiện protein

T4 tái tổ hợp

M: thang chuẩn, giếng 1: IPTG 1 mM, giếng 2: IPTG 2 mM, giếng 3: IPTG 3

mM, giếng 4: IPTG 4 mM, giếng 5: IPTG 5 mM, giếng 6: IPTG 6 mM,

Kết quả trong Hình 3.23 cho thấy, sau khi cảm ứng bằng IPTG, dòng

tái tổ hợp đã tổng hợp một lượng lớn protein có kích thước khoảng 25 kDa,

đúng với kích thước lý thuyết của protein T4 tái tổ hợp. Kết quả nghiên cứu

cho thấy hàm lượng protein tổng hợp được không phụ thuộc nhiều vào nồng

độ IPTG cảm ứng. Trong các nồng độ IPTG được khảo sát cho thấy gen T4

được biểu hiện tốt nhất khi chủng E.coliBL21-pET32a+-T4 được cảm ứng với

IPTG ở nồng độ 1 mM.

3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp

Protein T4 tái tổ hợp có gắn với 6 histidine ở đầu N, vì vậy có thể được

tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Nickel-Chelating Resin. Sinh khối vi khuẩn



chủng E.coliBL21-pET32a+-T4 được phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm,

protein tái tổ hợp hòa tan được chuyển lên cột sắc ký ái lực ProBond™

Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Các protein bám không đặc hiệu được

loại bỏ bằng imidazole 60 mM. Ở nồng độ này, hầu hết các protein bám

không đặc hiệu bị đẩy ra khỏi cột, và giữ lại protein T4. Protein này được tách

ra khỏi cột bằng dung dịch thẩm tách có chứa 200 mM immidazole. Các phân

đoạn protein thu được sau khi tách ra khỏi cột được kiểm tra trên gel SDSPAGE.

Kết quả điện di trên Hình 3.24 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh

sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước khoảng 25

kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng ngun T4.



Hình 3.24. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE

M: Thang protein chuẩn, giếng 1-5: kháng nguyên T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4, 5

Kết quả điện di trên Hình 3.24 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh

sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 25 kDa, trong

đó, phân đoạn 2 thu được lượng protein nhiều nhất. Chứng tỏ rằng protein T4

đã được tinh sạch thành công và đã sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ



hợp này vào thử nghiệm đánh giá khả năng tạo kháng thể nhằm tạo nguyên

liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú.

3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

trên thỏ

Việc sản sinh ra kháng thể trung hòa là tiêu chí quan trọng để đánh giá

một kháng ngun có thể sử dụng để sản xuất vắc-xin được hay không. Trong

nghiên cứu này của chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng kích thích tạo

kháng thể trung hòa trên thỏ bằng kháng nguyên E.coli BL21-pET32a+-T4 và

protein T4 tái tổ hợp.

Kháng nguyên E.coli BL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp sau

khi được tinh sạch thì được bổ sung chất bổ trợ Alumin hydroxide (AH) và

gây miễn dịch trên thỏ sạch bệnh. Sau 5 ngày gây miễn dịch chúng tôi tiến

hành thu huyết thanh thỏ để thực hiện các phản ứng trung hòa in vitro và in

vivo. Kết quả của thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.10 và Bảng 3.11.

Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử

thần kinh ở mơ hình in vitro

Thời gian thu

huyết thanh

thỏ sau khi

gây miễn

dịch (ngày)



Đối

chứng

dương

(CPE

%)



Đối chứng âm (CPE %)

E.coliBL21pET32a+-T4*



Protein T4

tái tổ hợp*



Độ pha loãng huyết thanh thỏ

được gây miễn dịch để trung hòa

liều gây nhiễm 104TCID50

E.coliBL21Protein T4 tái

+

*

pET32a -T4

tổ hợp*



5



98



0



0



ND



ND



15



98



0



0



1: 5



ND



25



98



0



0



1: 200



1: 50



35



98



0



0



1: 800



1: 200



45



98



0



0



1: 800



1: 200



60



98



0



0



1: 400



1:100



(Ghi chú: * Độ pha loãng cao nhất cho phản ứng trung hòa (khơng có CPE);

ND: huyết thanh khơng trung hòa vi rút cường độc)



Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử

thần kinh ở hệ thống in vitro thể hiện trong Bảng 3.10 cho thấy:

Các mẫu đối chứng âm, sử dụng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với

NNV để nuôi cấy trên tế bào mẫn cảm đã không gây hiệu ứng hủy hoại tế

bào. Các mẫu đối chứng dương cho thấy, huyết thanh thỏ bình thường khơng

có khả năng trung hòa NNV chủng QN2 cường độc, tất cả các giếng nuôi cấy

tế bào đều xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế bào.

Ở các lơ thí nghiệm vào ngày thứ 5 đều chưa sản sinh kháng thể trung

hòa NNV cường độc. Vào ngày thứ 15, chỉ có lơ huyết thanh của thỏ được

gây miễn dịch E. coli BL21-pET32a+-T4 bắt đầu sản sinh ra kháng thể ở độ

pha loãng huyết thanh là 1: 5. Huyết thanh thỏ được gây miễn dịch chứa E.

coli BL21-pET32a+-T4 và protein tái tổ hợp T4 đều sản sinh kháng thể từ

ngày thứ 25 sau khi gây miễn dịch. Tuy nhiên khả năng tạo kháng thể của các

mẫu huyết thanh là khơng tương đương nhau. Trong đó huyết thanh được tiêm

E. coli BL21-pET32a+-T4 trung hòa vi rút ở độ pha lỗng 1:200 là cao hơn so

với lô huyết thanh được tiêm protein tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:50.

Từ ngày thứ 35 đến 45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất ở cả hai lơ thí

nghiệm, trong đó lơ được tiêm E. coli BL21-pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá

trung hòa ở độ pha lỗng huyết thanh là 1:800, lơ được tiêm protein T4 tái tổ

hợp có hiệu giá trung hòa là 1:200. Vào ngày cuối cùng của thí nghiệm (ngày

thứ 60) thì ở cả hai lơ thí nghiệm hiệu giá trung hồ đều giảm, lơ được tiêm E.

coli BL21-pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá trung hoà là 1:400, còn lơ được

tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:100. Như vậy qua thí

nghiệm cho thấy tiềm năng để sử dụng kháng nguyên protein tái tổ hợp T4

mặc dù trong kết quả đạt hiệu giá kháng thể trung hòa chưa cao nhưng đây là

cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để sử dụng protein tái tổ hợp.

Ngoài việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử

thần kinh ở hệ thống in vitro chúng tơi còn bố trí thí nghiệm ở hệ thống in

vivo. Huyết thanh thỏ khỏe, khơng có kháng thể đặc hiệu với NNV được ủ với



chủng NNV cường độc QN2 và gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5g) bằng

phương pháp tiêm với liều 0,05 ml dịch vi rút với liều 103 LD50.

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử

thần kinh ở mơ hình in vivo được trình bày ở Bảng 3.11.

Bảng 3.11. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần

kinh ở mơ hình in vivo

Thời gian



Đối chứng



Đối chứng âm (tỷ lệ



Huyết thanh của thỏ được gây miễn



thu huyết



dương



nhiễm bệnh:%)



dịch



thanh thỏ

sau khi gây

miễn dịch

(ngày)



Nhiễm

bệnh

(%)



E. coli

Chết



BL21-



(%)



pET32a+T4



Protein

T4 tái tổ

hợp



E. coli BL21-



Protein T4 tái tổ



pET32a+-T4



hợp



Hiệu giá

trung hòa



Gen T4



Hiệu giá

trung hòa



Gen T4



5



100



100



0



0



ND



+



ND



+



15



100



100



0



0



ND



+



ND



+



25



100



100



0



0



1: 100



-



1: 50



-



35



100



100



0



0



1: 100



-



1: 50



-



45



100



100



0



0



1: 100



-



1: 50



+



60



100



100



0



0



1: 50



+



1: 10



+



(Ghi chú: ND: huyết thanh không trung hòa vi rút cường độc;

(+): có gen T4, (-): khơng có gen T4)

Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.11 cho thấy ở hai lơ thí nghiệm huyết

thanh của thỏ được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+-T4 và với

protein T4 tái tổ hợp thì trong thời gian đầu đến ngày thứ 15 huyết thanh thỏ

chưa tạo được kháng thể. Vào ngày thứ 25 kéo dài đến ngày thứ 45 ở lơ thí

nghiệm huyết thanh của thỏ được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+T4, sau khi gây miễn dịch, huyết thanh thỏ có khả năng tiết kháng thể trung



hòa NNV cường độc ở độ pha loãng huyết thanh là 1:100. Khi kiểm tra gen

mã hố kháng ngun T4 thì cho kết quả âm tính. Lơ thí nghiệm huyết thanh

được gây miễn dịch với protein T4 tái tổ hợp từ ngày thứ 25 đến ngày thứ 35

cho thấy độ pha loãng huyết thanh thỏ đạt hiệu giá 1:50 và không phát hiện

được gen mã hoá T4. Tuy nhiên sau 45 ngày theo dõi thí nghiệm cho thấy

hiệu giá trung hòa của huyết thanh đạt 1:50, tồn bộ cá mú thí nghiệm khơng

bị chết nhưng vẫn phát hiện được gen mã hóa kháng nguyên T4. Vào ngày thứ

60 (ngày cuối cùng của thí nghiệm), mặc dù ở cả hai lơ thí nghiệm huyết

thanh thỏ vẫn tạo được kháng thể trung hoà làm cho vi rút khơng còn khả

năng gây bệnh và hiệu giá trung hồ ở hai lơ thí nghiệm đạt từ 1:10 đến 1:50

nhưng trên cá mú khi xét nghiệm thì vẫn dương tính với gen T4.

Từ các kết quả trên cho thấy protein T4 tái tổ hợp có khả năng tạo

kháng thể trung hoà mặc dù kháng thể tạo ra thấp hơn so với chủng vi khuẩn

biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên E. coliBL21-pET32a+-T4.

Bên cạnh việc đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng

nguyên tái tổ hợp trên thỏ chúng tơi còn thực hiện đánh giá khả năng tạo

kháng thể trên cá mú thí nghiệm. Đây là tiêu chí quan trọng, là cơ sở cho việc

xác định tiềm năng sử dụng vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái

tổ hợp trên cá mú

Mặc dù trên thỏ có khả năng tạo kháng thể trung hoà với các kháng

nguyên là vi khuẩn E. coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp tuy

nhiên để xác định kháng nguyên có thể được sử dụng làm vắc-xin hay không,

chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng kích thích tạo kháng thể trực tiếp

trên cá mú nhằm ứng dụng vào sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá.

Các kết quả của thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.12 cho thấy: các mẫu đối

chứng âm khi cá được gây miễn dịch với kháng nguyên E. coliBL21-



115



pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp có kháng thể đặc hiệu với NNV để nuôi

cấy trên tế bào đã khơng gây hiệu ứng bệnh tích tế bào.

Bảng 3.12. Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV

trên mơ hình in vitro

Độ pha lỗng dịch chiết của cá được gây miễn dịch

để trung hòa NNV chủng QN2 (104TCID50)



Lơ thí nghiệm



15

ngày



Đối chứng dương

Dịch chiết cá gây miễn dịch

với E.coliBL21-pET32a+-T4

Dịch chiết cá gây miễn dịch

với protein T4 tái tổ hợp



30



45



60



75



90



ngày



ngày



ngày



ngày



ngày



+



+



+



+



+



+



-



-



-



-



-



-



-



-



-



-



-



-



1:256



1:128



1:128



1:64



1:8



1:128



1:128



1:64



1:64



1:8



Dịch chiết cá gây miễn dịch

với E.coliBL21- pET32a+-T4 1:64

và NNV cường độc

Dịch chiết cá gây miễn dịch

với protein T4 tái tổ hợp và



1:16



NNV cường độc

Ghi chú: +: có hiệu ứng bệnh tích tế bào

-: khơng gây hiệu ứng bệnh tích tế bào

Kết quả ở các mẫu đối chứng dương cho thấy, chủng NNV QN2 cường

độc với liều 104 TCID50 gây nhiễm vào tế bào lách cá mú GS1 thì tất cả các tế

bào được ni cấy đều có xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế bào.

Trong khi đó ở các lơ thí nghiệm, kháng ngun E.coliBL21-pET32a+-T4 và

protein T4 tái tổ hợp đều tạo ra được kháng thể đặc hiệu làm trung hoà vi rút

gây bệnh hoại tử thần kinh, kháng thể này được duy trì cho đến ngày thứ 90 ở

cả 2 lơ thí nghiệm. Nhìn chung kháng thể trung hòa được sản sinh ra ở cá mú

được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 cao hơn so với lơ thí



nghiệm cá được gây miễn dịch protein T4 tái tổ hợp. Trong đó độ pha lỗng

dịch chiết cá mú được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 cho

kháng thể trung hòa với vi rút NNV cường độc cao nhất ở ngày thứ 30 - 60,

đạt 1:128 - 1:256. Còn ở thí nghiệm dịch chiết cá mú được gây miễn dịch

với protein T4 tái tổ hợp, độ pha loãng dịch chiết cá mú tạo kháng thể trung

hòa vi rút NNV cường độc cao nhất ở ngày thứ 30 đến ngày thứ 45, đạt 1:128.

Độ pha loãng dịch chiết cá mú được gây miễn dịch với E.coliBL21pET32a+-T4 cho kháng thể trung hòa vi rút NNV cường độc cao nhất ở ngày

thứ 30 đến 60, đạt 1:128 - 1:256 và thời gian bảo hộ ở cá mú bột đối với

bệnh hoại tử thần kinh kéo dài cho đến ngày thứ 90 ở cả hai lơ thí nghiệm.

Đây là cơ sở khoa học vững chắc để ứng dụng vào sản xuất vắc-xin phòng

bệnh cho cá mú.

Hiện nay trên thế giới và Việt Nam mới chỉ có ít loại vắc-xin được sử

dụng để phòng bệnh cho một số lồi cá ni có giá trị kinh tế cao với quy mô

nuôi công nghiệp như cá hồi, cá vược, cá mú, cá tráp, cá chim nhưng chủ yếu

là vắc-xin bất hoạt.

Năm 2009, Yamashita và cs đã thử nghiệm dùng vắc-xin bất hoạt với

formalin để phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 7 vạch (E.

septemfasciatus) giai đoạn cá nhỏ (khối lượng trung bình 25,4 g/con) tại Nhật

Bản. Sau 20 ngày thử nghiệm tiêm vắc-xin ở các mức liều lượng TCID50/cá:

108,5, 108,0, 107,5, 107,106,5 thì mức kháng thể trung hòa tạo ra tương ứng là

1:907, 1:511, 1:259, 1:197 và 1:96 trong khi đó cá ở các lơ đối chứng khơng

sản sinh kháng thể (Yamashita và cs, 2009) [69]. So với nghiên cứu trên đề

tài của chúng tôi đã sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp gây nhiễm

trên cá mú bột với liều lượng dùng thấp hơn (104 TCID50), sau 30 đến 45 ngày

hiệu giá trung hòa đạt mức cao nhất trong 90 ngày thí nghiệm là 1:128.

Với vắc-xin bất hoạt chủng RGNNV, Pakingking và cs (2010) đã thử

nghiệm tiêm để phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (E. fuscogutattus)

giai đoạn nuôi thương phẩm. Kết quả phân tích huyết thanh cá đã được tiêm



vắc-xin cho thấy kháng thể trung hòa được sản sinh ra từ ngày thứ 15 (hiệu

giá 1: 800) và kéo dài đến 190 ngày (hiệu giá 1:400). Công cường độc vào

ngày thứ 30 và ngày 75. Tỷ lệ sống của cá được tiêm vắc-xin cao hơn nhiều

so với cá nuôi đối chứng (tiêm môi trường Leibovitz’s 15) [51].

Tại Việt Nam, vắc-xin bất hoạt keo phèn được dùng phòng bệnh hoại tử

thần kinh ở cá mú ni quy mơ cơng nghiệp có hiệu quả rất rõ rệt, vắc-xin có

tỷ lệ bảo hộ cá ở điều kiện thí nghiệm đạt 83% trên cá giống. Ngồi ra vắc-xin

còn sử dụng cho ni cá mú lồng và ao giai đoạn thương phẩm để phòng bệnh

VNN hiệu quả cao, tỷ lệ bảo hộ cho cá đạt 82% (Phạm Thị Tâm và cs, 2015)

[6].

Như vậy, các nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước cho

thấy sử dụng vắc-xin là biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh hoại tử thần kinh

cho cá mú hiện nay. Bên cạnh vắc-xin bất hoạt thì việc phát triển vắc-xin tái

tổ hợp thế hệ mới là cần thiết nhằm giảm thiểu rủi ro cho nghề nuôi cá mú.

Mặc dù với kết quả bước đầu cho thấy khả năng sản sinh kháng thể của kháng

nguyên tái tổ hợp trên thỏ cũng như trên cá mú chưa cao nhưng kết quả trên

đã cho thấy tiềm năng sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp. Đây là cơ sở khoa

học để có thể sử dụng kháng nguyên làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắcxin thế hệ mới phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá biển nói chung và cá mú

ni cơng nghiệp tại Việt Nam.



KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Qua nghiên cứu chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút gây bệnh hoại tử

thần kinh trên cá mú tại Việt Nam. Các chủng vi rút xác định được đều là

Nervous Necrosis Virus (NNV) thuộc họ Betanodavirus.

2. Vi rút xác định được có các đặc tính sau:

- Vi rút có khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1. Trong số 26 chủng vi

rút xác định được thì có 6 chủng độc lực cao với TCID 50 đạt từ 10-6,8 đến

10-6,9; 10 chủng độc lực đạt TCID 50 từ 10-4,8 đến 10-4,9; 10 chủng độc lực

yếu, TCID50 đạt từ 10-2,7đến 10-4,3.

- Vi rút có khả năng gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú, kết quả

nghiên cứu đã xác định 2 chủng có độc lực cao với LD 50 = 10-7,5, 4 chủng

độc lực với LD50 từ 10-5,5 đến 10-6,5, 2 chủng có độc lực thấp, LD50 từ 102,6



đến 10-3,6.



- Vi rút thích nghi và phát triển tốt nhất trên tế bào GS1 khi chúng được nuôi

cấy ở điều kiện nhiệt độ 220C.

- Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi rút xác định được trên

cá mú: Tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày nuôi từ 82,1 đến 85,5% và sau 6 ngày

ni thì cá chết hồn tồn ở cả hai điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ 28 0C cả

ngày đêm và nhiệt độ biến thiên 280C ban ngày, 240C ban đêm.

3. Đề tài đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp. Kháng nguyên được

biểu hiện thành cơng trong tế bào E. coliBL21(DE3) có kích thước khoảng

25 kDa. Protein T4 tái tổ hợp có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho

cá mú với hiệu giá kháng thể trung hoà đạt 1:128 từ ngày thứ 30 đến ngày thứ

45 và hiệu giá kéo dài cho đến ngày thứ 90 của thí nghiệm. Đây là cơ sở khoa

học vững chắc để có thể ứng dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm

nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.



KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thu được lượng protein T4 nhiều

nhất nhằm sản xuất được lượng lớn kháng nguyên làm nguyên liệu phục vụ

sản xuất vắc-xin sau này

2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên cá mú nuôi ở giai đoạn cá

hương, cá giống để xác định thời gian bảo hộ của kháng nguyên tái tổ hợp đối

với cá.

3. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi kiến nghị tiếp tục triển

khai nghiên cứu tạo vắc-xin tái tổ hợp thế hệ mới để phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú tại Việt Nam.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×