Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Kết quả kiểm tra mô bệnh học xác định bệnh tích trong các cơ quan

đích của vi rút (trong mơ mắt và não cá) cho thấy có hiện tượng xuất hiện các

không bào chứa cấu trúc thể vùi của vi rút ở dạng tiềm tan (Hình 3.1).

Bảng 3.1. Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mơ bệnh học

Bệnh tích tế bào trong mơ não cá



Bệnh tích tế bào trong mơ mắt cá



(26 mẫu)



(17 mẫu)



Ký hiệu mẫu



Tỷ lệ (%)



Ký hiệu mẫu



Tỷ lệ (%)



QN2, QN4, QN7



37,50



QN2, QN4, QN7



37,50



HP2, HP4, HP5, HP8, HP10



45,45



HP4, HP5, HP8



27,27



NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5,

NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11

KH4, KH5, KH6, KH9

BT1, BT2, BT4, BT7, BT9,

BT12

Trung bình



72,72

44,44

50,00

50,98



NĐ1, NĐ4, NĐ5,

NĐ10, NĐ11

KH4, KH5

BT2, BT4, BT9,

BT12

Trung bình



45,45

22,22

33,33

33,33



Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 51 mẫu cá mú thu được thì

có 26 mẫu xuất hiện không bào trong các mô não với tỷ lệ nhiễm CPE trung

bình là 50,98%. Các khơng bào trong mẫu kiểm tra có dạng hình tròn hoặc

hình elip, kích thước khơng bào từ 5-10 µm. Trong q trình kiểm tra thấy 17

mẫu cá có khơng bào ở mơ mắt, tỷ lệ nhiễm CPE trung bình đạt 33,33%. Các

khơng bào ở mơ mắt thì ln có trong mơ não, ở các mẫu này không bào xuất

hiện dày đặc trong mơ não.

Qua quan sát chúng tơi khơng nhận thấy có sự khác biệt giữa kích

thước khơng bào ở mơ mắt và mơ não, cũng như trong cùng 1 mơ thì có thể

xuất hiện cả khơng bào hình tròn và khơng bào hình elip. Việc khơng bào xuất

hiện nhiều hay ít có thể còn phụ thuộc q trình phát triển của bệnh. Những

mẫu có số lượng khơng bào ít thì có khả năng là những mẫu đang ở giai đoạn

đầu của bệnh, khi số lượng vi rút xâm nhập vào tế bào ký chủ còn chưa nhiều.



Theo Comps và cs (1996) [28], cá mú có biểu hiện của bệnh hoại tử

thần kinh, khi quan sát mô bệnh học cho thấy NNV đã phá hủy tế bào thần

kinh của cá và tạo ra các khơng bào có hình dạng, kích thước khác nhau.

Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên (2008) [3] mẫu mô bệnh học trên cá

mú chấm nâu, cá chẽm, cá bớp có dấu hiệu VNN ni tại Khánh Hòa cũng

chỉ ra tác nhân gây bệnh đã phá hủy các tế bào thần kinh và võng mạc mắt

của cá. Ở các mơ mắt và mơ não đã tìm thấy sự tồn tại của hai dạng khơng

bào là dạng hình tròn và hình elip với kích cỡ từ 4 đến 30 µm.

Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tơi hồn tồn tương tự như

thông báo của các tác giả trên và NNV đã được tìm thấy ở 26 mẫu bệnh

phẩm. Các mẫu còn lại tuy khơng thấy khơng bào xuất hiện nhưng khơng nằm

ngồi khả năng đang ở thời kỳ tiền nhiễm. Do đó việc xác định vi rút bằng

phương pháp sinh học phân tử tiếp tục được tiến hành để xác định gen mã hóa

kháng nguyên bề mặt của NNV.

3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương

pháp RT-PCR

Các mẫu cá mú nhiễm NNV tiếp tục được kiểm tra bằng phương pháp

RT-PCR (PCR phiên mã ngược) để phát hiện gen mã hóa kháng nguyên đặc

hiệu T4 của NNV.

Theo Nishizawa (1997) [47], gen mã hóa kháng nguyên của NNV nằm

trên cấu trúc RNA2 của vi rút, các gen này là hai vùng bảo tồn cao, bao gồm

T2 (870 bp) và T4 (420 bp), trong đó đoạn gen có kích thước 416 bp, nằm

trên T4 là cấu trúc quyết định tính đa dạng của các genotype của NNV. Dựa

trên trình tự gen T4, chúng tơi đã thiết kế được cặp mồi khuyếch đại có trình

tự:

P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và

P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’)

Kết quả xác định mẫu thông qua việc phát hiện gen T4 được trình bày

trong Bảng 3.2 và Hình 3.1.



Bảng 3.2. Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương

pháp RT-PCR

Số mẫu dương tính với gen T4 của NNV

(27 mẫu)



Tỷ lệ (%)



QN2, QN4



25,00



HP2, HP4, HP6, HP7, HP8, HP10, HP11



63,63



NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11



72,72



KH4, KH5, KH9



33,33



BT2, BT3, BT4, BT7, BT9, BT10, BT12



58,33



Trung bình



52,94



Kết quả kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp

RT-PCR được thể hiện ở bảng 3.2 cho thấy: trong tổng số 51 mẫu cá mú nghi

nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thì có tới 27 mẫu dương tính với gen mã hố

kháng ngun của vi rút gây bệnh chiếm tỷ lệ 52,94% trong đó tỷ lệ mẫu cá

dương tính với gen T4 gặp nhiều là ở Nam Định (72,72%), Hải Phòng

(63,63%) và Bình Thuận (58,33%).

Sản phẩm PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV là HP1, HP2,

NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH 5, BT2 và BT3 được thể hiện ở Hình 3.2.

Kết quả điện di đồ (Hình 3.2) cho thấy: các mẫu HP2, NĐ3, QN2,

QN4, KH4, KH5, BT2, BT3 xuất hiện băng có kích thước khoảng 420 bp

tương ứng với kích thước đoạn gen T4. Các mẫu HP1, NĐ2 không thấy xuất

hiện băng tương ứng với kích thước gen này.



Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi

nhiễm NNV

(Giếng 1-10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5,

BT2, BT3, Giếng 11: marker)

Kết quả PCR xác định gen đặc hiệu T4 của NNV cho thấy: trong tổng

số 51 mẫu cá kiểm tra thì có 27 mẫu dương tính với đoạn gen T4 của NNV.

Như vậy qua các kết quả ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 chúng tơi nhận thấy có sự

khác biệt giữa hai phương pháp chẩn đoán để xác định vi rút gây hoại tử thần

kinh trên 51 mẫu cá mú kiểm tra. Qua nghiên cứu cho thấy phương pháp RTPCR cho kết quả sàng lọc chính xác hơn so với phương pháp mơ bệnh học.

Trong 51 mẫu cá được kiểm tra thì có 4 mẫu gồm HP6, HP7, BT3, BT10

khơng có biểu hiện bệnh tích tế bào nhưng lại phát hiện được gen đặc hiệu T4

của NNV. Như vậy các mẫu này có thể nhiễm vi rút với số lượng thấp, bệnh

đang ở giai đoạn đầu nên chưa có biểu hiện bệnh tích ở các tế bào mơ đích.

Ngược lại, các mẫu QN7, HP5, KH6 và BT1 có biểu hiện lâm sàng, gây bệnh

tích ở mơ não và mơ mắt giống với bệnh hoại tử thần kinh nhưng lại không

phát hiện được gen đặc hiệu của NNV. Theo các nghiên cứu về bệnh do vi rút



gây ra trên cá biển nói chung và cá mú nói riêng cho đến hiện nay mới chỉ

phát hiện được 2 nhóm tác nhân chính là Betanodavirus gây bệnh hoại tử thần

kinh và Irodovirus gây bệnh ngủ trên cá. Như vậy, từ kết quả thu được như

trên chúng tôi cho rằng các chủng QN7, HP5, KH6 và BT1 có thể là nhiễm

Iridovirus tác nhân gây bệnh ngủ trên cá mú.

Ở Việt Nam, bệnh hoại tử thần kinh đã được phát hiện lần đầu tiên vào

năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp.) ni lồng ở Vân Đồn (Quảng Ninh).

Ngồi ra một số loài như cá mú chấm nâu (E. coioides) ni tại Cát Bà (Hải

Phòng), Cửa Hội (Nghệ An), một số lồi cá biển ni ở Khánh Hòa như cá

mú, cá chẽm, cá bớp (cá giò) (Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên, 2008) [3] và

gần đây vi rút gây hoại tử thần kinh còn được phát hiện trên cá Chình ở vùng

biển miền Trung (Phạm Thị Tâm và cs, 2015) [6]. Cá mú khi nhiễm bệnh hoại

tử thần kinh thường gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá

của người dân vùng ven biển nước ta.

Như vậy, qua phương pháp chẩn đoán RT-PCR cho phép chúng tơi

khẳng định trong 51 mẫu cá thì có 27 mẫu dương tính với đoạn gen T4 của

NNV và chúng tôi tiếp tục sử dụng 27 mẫu vi rút này gây nhiễm trên tế bào

GS1 để xác định vi rút gây bệnh.

3.1.3. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào

Theo nghiên cứu của Hegde (2003) [36] tại Singapore, NNV là vi rút

không gắn chặt tế bào, vi rút đã được phân lập từ cá mú mỡ (Epinephelus

tauvina) và được nuôi trên tế bào SB (sea bass). Vi rút đã gây hủy hoại màng

tế bào, tạo ra các vùng tế bào chết và dẫn đến hiện tượng tan bào. Sự thay đổi

mơ bệnh học điển hình trên cá mú gây nhiễm cho thấy sự xuất hiện các không

bào ở các mô hoại tử.

Theo Quin và cs (2006) [55], NNV thích nghi tốt trên tế bào GS1 vì

vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng tế bào GS1 để đánh giá khả

năng gây nhiễm của NNV.



Đề tài đã tiến hành gây nhiễm 27 mẫu bệnh phẩm dương tính với đoạn

gen T4 đặc hiệu của NNV trên tế bào GS1 và đã xác định được 26 chủng vi

rút tương ứng. Kết quả xác định vi rút trên tế bào được trình bày ở Bảng 3.3.

Sự có mặt của vi rút trong các mẫu cá bệnh được đánh giá bằng chỉ số

CPE. Khi ni cấy vi rút trên dòng tế bào GS1 cho thấy: sau 24 giờ tế bào bắt

đầu có hiện tượng tế bào kết hạt, co tròn, trong tế bào có hình thành nhiều hạt

khơng bào kích thước đa dạng; theo dõi đến 120 giờ cho thấy các tế bào chết

cục bộ ở khắp bề mặt đĩa ni cấy và tới 168 giờ, tồn bộ tế bào bị phá hủy

hoàn toàn bởi hiện tượng tan bào, các lớp tế bào bị bong tróc khỏi mặt bình

ni cấy (Hình 3.3).



Hình 3.3. Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV

A: Tế bào GS1 sau gây nhiễm 48 giờ, tế bào kết hạt và co tròn

B: Tế bào GS1 sau 168 giờ gây nhiễm NNV

C: Không bào trong tế bào GS1 sau 48 giờ nhiễm NNV.

Theo Iwamoto và cs (2000) [39], trên một số loài cá mú như E.

coioides, E. fuscoguttatus, E. akaara, E. septemfasciatus, E. mooara có nhiễm

Betanodavirus thì thuộc kiểu gen RGNNV. Nhiệt độ ni cấy vi rút phù hợp

trong khoảng 25 - 30oC. Trên dòng tế bào SSN-1 xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế

bào vào ngày thứ 3 với dấu hiệu đặc thù là các tế bào co tròn riêng rẽ, chứa

khơng bào ở tế bào chất và phá huỷ hoàn toàn lớp tế bào vào ngày thứ 7.



Các kết quả nghiên cứu của chúng tơi trên dòng tế bào GS1 hồn tồn

tương tự như cơng bố của các tác giả trên: đó là hiệu ứng bệnh tích tế bào xảy

ra sau 48 giờ (sang ngày thứ 3) với đặc thù là các tế bào có hiện tượng kết hạt

và co tròn, có nhiều không bào trong tế bào chất. Tuy nhiên theo các tác giả

thì sự phá huỷ hồn tồn lớp tế bào xảy ra vào ngày thứ 7 (168 giờ). Trong

kết quả của đề tài thì phần lớn các chủng vi rút gây bệnh tích 50% tế bào sau

144 giờ (6 ngày) đến 168 giờ (7 ngày) gây nhiễm vi rút và q trình gây bệnh

tích tế bào chậm hơn so với nghiên cứu của Iwamoto và cs (2000) [39] đã

công bố.

Như vậy với các phương pháp mô bệnh học và RT-PCR đã sàng lọc

được 27 mẫu bệnh phẩm, các mẫu này được sử dụng để phục vụ các nghiên

cứu tiếp theo về xác định vi rút. Kết quả xác định vi rút thể hiện trong Bảng

3.3 cho thấy, NNV thích nghi tốt trên tế bào GS1. Từ 27 mẫu bệnh phẩm

dương tính với NNV chúng tơi đã xác định được 26 chủng vi rút tương ứng.

Riêng mẫu HP11 khơng có biểu hiện bệnh tích trên tế bào, có thể vi rút đang

ở giai đoạn tiền nhiễm, số lượng vi rút ký sinh trong tế bào ít.

Mức độ gây bệnh tích trên tế bào của các chủng vi rút xác định được là

khác nhau. Tuy nhiên từ kết quả nghiên cứu thu được đã chứng tỏ chúng

thuộc nhóm vi rút khơng gắn chặt tế bào, gây bệnh tích trên tế bào chậm,

phần lớn các chủng đều gây bệnh tích 50% tế bào sau 144 giờ (6 ngày) đến

168 giờ (7 ngày) gây nhiễm và chúng chính là các chủng NNV.



Bảng 3.3. Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1



Thời gian xảy ra hiệu ứng CPE (giờ)

STT hiệu

24

48

72

96

120

144

168

mẫu

1 QN2

_

_

+

+

++

+++

++++

2 QN4

_

+

+

+

++

+++

++++

3 HP2

_

_

+

+

+

++

+++

4 HP4

_

+

+

+

++

+++

++++

5 HP6

_

_

+

+

+

++

+++

6 HP7

_

+

+

+

++

+++

++++

7 HP8

_

+

+

+

++

+++

++++

8 HP10

_

_

+

+

+

++

+++

9 HP11

_

_

_

_

_

_

_

10 NĐ1

_

+

+

+

++

+++

++++

11 NĐ3

_

_

+

+

+

++

+++

12 NĐ4

_

+

+

+

++

+++

++++

13 NĐ5

_

+

+

+

++

+++

++++

14 NĐ7

_

_

+

+

+

++

+++

15 NĐ8

_

+

+

+

++

+++

++++

16 NĐ10

_

_

+

+

+

++

+++

17 NĐ11

_

_

+

+

+

++

+++

18 KH4

_

_

+

+

+

++

+++

19 KH5

_

+

+

+

++

+++

++++

20 KH9

_

_

+

+

+

++

++

21 BT2

_

_

+

+

+

++

++++

22 BT3

_

+

+

+

++

+++

++++

23 BT4

+

+

+

++

+++

++++

24 BT7

_

+

+

+

++

+++

++++

25 BT9

+

+

+

++

++

+++

26 BT10

+

+

+

++

++

++

27 BT12

+

+

+

++

++++

Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++ : CPE > 50%; +:

CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: khơng có CPE

Mức độ gây bệnh tích tế bào ở các mẫu nghiên cứu được thể hiện rõ nét ở

Hình 3.4



Hình 3.4. Mức độ gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) khi gây nhiễm

NNV trên tế bào GS1



Ghi chú:



A: (-) khơng có CPE

B: (±) nghi ngờ có CPE > 10%

C: (+)



có CPE > 20%



D: (++) có CPE > 50%

E: (+++) có CPE > 85%

F: (++++) có CPE > 98%

Như chúng tơi đã trình bày, các chủng vi rút xác định được trên tế bào

GS1 có thể là vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá với các đặc điểm như

có gen T4 là gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu của NNV và gây bệnh tích

trong tổ chức thần kinh trung ương (mơ não và mô mắt) của cá. Để khẳng

định lại cho nhận định trên chúng tơi tiếp tục giải trình tự gen T4 nhằm phân

loại đến lồi.

3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV.

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú không phải là bệnh mới xuất hiện ở

Việt Nam, tuy nhiên đây là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở cá ít được nghiên

cứu. Bệnh có khả năng tạo thành dịch nếu cơng tác kiểm sốt dịch bệnh

khơng tốt và có thể gây chết hàng loạt cá mú ni. Vì vậy để thận trọng trong

việc xác định lồi vi rút gây bệnh ở cá mú chúng tôi đã xác định gen T4 mã

hóa kháng nguyên đặc hiệu của NNV và giải trình tự để xác định chính xác

đến lồi.

Dựa trên đặc tính gây bệnh tích điển hình của các chủng vi rút trên mô

não, mô mắt cũng như mức độ biểu hiện lâm sàng rất rõ trên cá mú, chúng tôi

đã lựa chọn các chủng NNV đại diện gồm: QN2, QN4, HP8, NĐ1, KH5,

BT12 để tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng ngun T4.

Các kết quả dưới đây thể hiện các bước xác định trình tự gen T4 của

chủng KH5.



Hình 3.5. Thiết kế vector tái tổ hợp pGEM-T- T4

A: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch gen T4 (giếng1: sản phẩm T4 tinh sạch;

giếng M: 1kb Plus Ladder);

B: sơ đồ thiết kế vector tách dòng gen T4

Sản phẩm sau khi tinh sạch có kích thước khoảng 420bp, tương đương

với kích thước lý thuyết của gen T4 (Hình 3.5A).

Đoạn gen thu được sau khi tinh sạch sẽ được sử dụng để thực hiện quy

trình tách dòng bằng vector pGEM-T Easy, vector tái tổ hợp được thiết kế

theo Hình 3.5B.

Vector tách dòng tái tổ hợp pGEM-T-T4 được biến nạp bằng phương

pháp sốc nhiệt vào E. coliJM109, vi khuẩn tái tổ hợp được sàng lọc trên đĩa

môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin với nồng độ 100 µg/ml, chất

chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG. Chọn lọc các khuẩn lạc trắng rồi nuôi

trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilin 100 µg/ml để tách plasmid tái

tổ hợp và cắt, tinh sạch gen T4. Sản phẩm DNA plasmid tách từ các khuẩn lạc

trắng được kiểm tra trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.6 (A), kiểm tra sản

phẩm PCR khuếch đại gen T4 thể hiện trong Hình 3.6 (B), kiểm tra sản phẩm

cắt bằng enzyme giới hạn thể hiện trong Hình 3.6 (C).



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×