Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI

Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI

Tải bản đầy đủ - 0trang

3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy

hết.

4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C.

5. Hút 400 µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc.

6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer vào cột, trộn đều rồi ủ ở

nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía

dưới.

7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5

phút.

8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột

tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml.

9. Bổ sung 50 µl TE buffer vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

10.



Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh



sạch, thu các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C

* Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

Gen T4 trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy

giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình

được thực hiện theo bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing. Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương

đồng của trình tự gen T4 thu được với các trình tự của GenBank.

2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử

thần kinh (NNV)

2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1

- Độc lực của vi rút được xác định bằng phương pháp chuẩn độ trên

đĩa nhựa 96 giếng.

Trước khi chuẩn độ 1 ngày, đĩa nhựa 96 giếng được cấy mỗi

giếng khoảng 7x104 tế bào GS1. Dịch vi rút được tiến hành pha

lỗng từ 10-1 đến 10-9 với mơi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS).

- Mỗi độ pha loãng cấy vào 4 giếng, mỗi giếng cấy 0,1 ml dịch vi rút.

Giữ khay đã cấy ở nhiệt độ 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Sau



2

g

i



,

h

ú

t



hết dịch trong các giếng và chuyển vào mỗi giếng 0.5 ml môi trường

Leibovitz’s 15 (10% FCS). Bọc khay lại và để ở nhiệt độ 28 oC trong tủ ấm

CO2 0,5%.

- Quan sát và đếm số giếng có CPE trong 5 ngày.

Khả năng gây bệnh của vi rút trên tế bào GS1 được đánh giá qua chỉ số

TCID50 (nồng độ gây chết 50% tế bào). Áp dụng phương pháp chuẩn độ của

Reed và Muench (1938) [57] để xác định TCID50

LgTCID50= lgA+ x1lgf

LgTCID50= lgA+ x2lgf

Trong đó: f là hệ số pha lỗng



A1: tỷ lệ cận trên có bệnh tích



A: độ pha lỗng với tỷ lệ cận trên có bệnh tích



B1: tỷ lệ cận dưới có bệnh tích



B: độ pha lỗng với tỷ lệ cận dưới có bệnh tích



2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú

- Bố trí thí nghiệm: Từ kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi rút

trên tế bào, tiến hành lựa chọn một số chủng NNV có độc lực cao và độc lực

thấp trên tế bào để thí nghiệm xác định độc lực của các chủng NNV trên cá

mú.

Dịch vi rút được pha loãng từ 10 -1 đến 10-9, mỗi độ pha loãng vi rút

tiêm 30 cá mú con có kích thước 1,5-2 cm, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần.

Liều tiêm dịch vi rút: 0,1 ml/con và tiêm vào dưới gốc vây đuôi. Lô đối chứng

cá được tiêm nước muối sinh lý. Sau tiêm truyền, theo dõi cá sau 6 giờ đến 5

ngày để quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa

kháng nguyên T4 của NNV.

Khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú được đánh giá bằng liều gây

chết 50% cá thí nghiệm: LD50 (Lethal Dose). LD50 được tính dựa theo phương

pháp của Reed và Muench (1938) [57].



LgLD50 = αlgb + lgc

Trong đó:



b = Độ pha lỗng của vi rút, trong thí nghiệm này b = 1/10 (10-1);

c = Độ pha loãng vi rút gây tỉ lệ chết cận trên 50%.

2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi

rút trên tế bào GS1

Lựa chọn 1 chủng vi rút (QN4) có chỉ số TCID 50 cao để nghiên cứu ảnh

hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của NNV trên tế bào GS1.

Chủng NNV được gây nhiễm vào tế bào GS1 với mật độ tế bào ban đầu là

22x102 tế bào/mm2. Tế bào gây nhiễm NNV được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt

độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID 50 = 10-6,8. Sau 5 ngày nuôi

cấy tiến hành đánh giá CPE và xác định mật độ tế bào còn sống sót. Thí

nghiệm được bố trí theo hình 2.2.



Hình 2.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm

của vi rút trên tế bào



2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của

vi rút trên cá mú

Thí nghiệm được trình bày ở hình 2.3.



Hình 2.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm

của vi rút trên cá mú

NNV chủng QN4 có liều LD50 cao (10-7,5) được chọn để gây nhiễm vào

cá mú con bằng phương pháp tiêm dưới gốc vây đi. Bố trí 3 bể ni cá thí

nghiệm, mỗi bể tiêm 30 cá mú. Lô đối chứng cá được tiêm môi trường

Leibovit’z 15. Cá được nuôi trong 2 điều kiện nhiệt độ là: 28 0C (cả ngày đêm)

và 280C (ban ngày)/240C (ban đêm). Theo dõi cá, xác định tỷ lệ chết và sự có

mặt của gen T4 sau 15 ngày.

2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá

khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen

Vector pET32a+ sẽ được cắt mở vòng bởi enzyme BamHI và EcoRI để

có thể nhận đoạn gen T4. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H 2O

(7,6 μl): Buffer (1μl): EcoRI (0,4 μl): pET32a+ (1 μl). Ủ ống phản ứng ở 37 oC

trong 3 giờ.



2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+

Phản ứng được thực hiện với thành phần như sau: H 2O (6 μl): T4 DNA

(1 μl): vector pET32a+(1 μl): Ligate Buffer (1 μl): T4 Ligate (1 μl). Ủ ống

phản ứng ở 4oC từ 14 đến 16 giờ.

2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109

Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector tái tổ hợp mang gen T4

(pET32a+-T4) vào tế bào vi khuẩn E. coli. Các bước thực hiện như sau:

Lấy 1 khuẩn lạc E. coliJM109 nuôi trong 20 ml LB lỏng ở điều kiện

370C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm.

Lấy 0,5 ml canh trường E. coli chuyển sang bình 50 ml LB, ni ở điều

kiện 370C, lắc 200 vòng/phút, từ 1 đến 3 giờ đến khi đạt OD từ 0.4 đến 0.6.

Chuyển sang ống ly tâm 50 ml để trên đá 30 phút. Sau đó ly tâm 4.000

vòng/phút/40C trong 10 phút. Bỏ dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn.

Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vơ trùng để lạnh. Sau đó ly

tâm 3500 vòng/phút/40C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào.

Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0.1 M đã thanh trùng để trên đá

khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút/40C trong 10 phút, loại bỏ

dịch thu sinh khối tế bào.

Hòa tan tế bào trong 1 ml dung dịch (CaCl 2 0,1 M có bổ sung 15%

glycerol) đã vơ trùng để lạnh trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn, chia ra các ống

eppendorf, mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -200C.

- Thực hiện chuyển gen: Trộn 4 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào E.

coliJM109 khả biến, đảo trộn bằng pipette, ủ trên đá 30 phút, sốc nhiệt ở 42 oC

trong thời gian 1 phút. Lập tức chuyển sang ủ trên đá 10 phút. Bổ sung 600 µl

LB lỏng, ni lắc 200 vòng/ phút ở 37 oC trong thời gian 1 giờ. Sau đó cấy

trang dịch tế bào lên mơi trường LB rắn có bổ sung kháng sinh Ampicillin với

nồng độ 100 µg/ml, ni ở 37oC trong thời gian từ 14 đến 16 giờ.



2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra

bằng PCR và enzyme giới hạn.

a, Tách chiết plasmid

- Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút với thời gian từ 14 đến 16

giờ. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC trong 6 phút. Loại bỏ dịch thu sinh

khối tế bào.

- Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ.

- Bổ sung 400 µl Solution II, đảo nhẹ.

- Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ đến khi xuất hiện kết tủa, để yên khoảng

2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4 oC trong 10 phút, hút 500 µL

dịch nổi vào eppendorf mới.

- Bổ sung 500 µl isopropanol lạnh vào eppendort chứa dịch, đảo đều, để yên từ

1 đến 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn (DNA

kết tủa).

- Bổ sung 1 ml ethanol 70% lạnh vào eppendort chứa cặn, ly tâm

10.000 vòng/phút/4oC trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn. Thực hiện 2 lần

liên tục.

- Đợi cồn bay hơi đến khơ, bổ sung H2O de-ion để hòa tan DNA .

- Bảo quản ở -200C.

b, Kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn

- Kiểm tra bằng PCR: Phản ứng PCR sẽ khuếch đại đoạn gen T4 (nếu có) trong

plasmid tách chiết được. Thành phần phản ứng được thực hiện như sau:

STT

1

2

3

4

5



Thành phần

Master mix 2x

H2O

Primer 1

Primer 2

DNA template

Tổng số



Thể tích (µl)

25

22

0,5

0,5

2

50



Chu trình nhiệt của phản ứng: 94oC trong 5 phút, 94 oC trong 30 giây,

60 oC trong 30 giây, 72 oC trong 30 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72 oC

trong 5 phút và giữ ở 4 oC. Sản phẩm của phản ứng sẽ được kiểm tra bằng

điện di trên gel agarose 1%.

• Kiểm tra bằng enzyme giới hạn:

Plasmid sau tách chiết được sử sụng làm nguyên liệu cho phản ứng cắt

bằng các enzyme giới hạn BamHI và EcoRI để kiểm tra sự có mặt của đoạn

gen T4 trong các plasmid. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H 2O

(7,6 μl): Buffer (1 μl): EcoRI (0,4 μl): DNA plasmid (1 μl).

2.3.3.5 Nuôi cấy E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4

E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a +-T4 được ni cấy hoạt

hóa trong mơi trường LB lỏng qua đêm ở 37 oC, nuôi lắc 200 lần/phút. Theo

hướng dẫn của hãng Novagen, điều kiện biểu hiện ban đầu được đưa ra là

hoạt hóa vi khuẩn để OD đạt khoảng 0,6 – 0,8 thì cảm ứng bằng IPTG ở nồng

độ 0,6 - 1 mM, nuôi lắc 37 oC, sau 3 đến 4 giờ protein sẽ được biểu hiện.

Protein tái tổ hợp sẽ được kiểm tra điện di SDS-PAGE và Western blot.

2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE

Pha lớp Separating gel 10% (5 ml) với tỷ lệ như bảng sau

Acrylamide stock solution 30%



1,67 ml



Tris-HCl 1 M, pH 8.8



1,9 ml



H2O



1,33 ml



Trộn đều dung dịch của lớp gel separating sau đó hút và bơm dịch vào

buồng gel tới khi mức gel cách mép trên bản thuỷ tinh 1,5 cm.

- Phủ 1 lớp nước hoặc n-propanol lên trên bề mặt lớp gel vừa đổ, q trình

polymer hố sẽ hồn thành khoảng 1 giờ, đổ bỏ lớp nước phía trên.



- Tiếp tục pha gel Stacking 5% (2 ml) theo tỷ lệ như sau:

Acrylamide stock solution 30%



330 µl



Tris-HCl 1 M, pH 6.8



250 µl



H2O



1,38 ml



SDS 10%



20 µl



AP 10%



20 µl



TEMED



2 µl



- Đổ tiếp lớp gel stacking lên trên cho tới khi đầy buồng gel, đặt lược tạo giếng.

Quá trình polymer hố gel khoảng 30 phút. Khi bản gel đã hoàn thành, toàn

bộ bản gel được đặt trong buồng điện di có chứa dung dịch điện di và rút lược

tạo giếng.

- Nhỏ mẫu: Kháng nguyên sau khi đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau, mỗi

giếng nhỏ 15-20 µl kháng nguyên và 10 µl marker chuẩn. Mẫu trước khi nhỏ

cần được biến tính ở 100oC trong 5 phút.

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 120 -180 V (thường là ở 150 V), đến khi màu

thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách.

- Nhuộm bản gel bằng Coomassie blue R–250 0,1% (Methanol: glacial acetic

acid: nước = 4:1:5) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và lắc.

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy (Methanol: glacial acetic acid: nước = 1:1:8) lắc,

thay dịch tẩy khoảng 2 – 3 lần đến khi thấy các vạch xuất hiện.

Dựa vào kích thước kháng nguyên trên bản gel để bước đầu kiểm tra

kháng nguyên tạo ra có phải là kháng nguyên T4 mong muốn hay không.

2.3.3.7. Phương pháp Western blot

Phức hợp protein T4 đã có được sau tinh sạch, được phân tách bằng

điện di gel SDS-PAGE, ủ gel trong transfer buffer trong 10 phút.

- Cắt các mảnh giấy lọc và màng PVDF theo kích thước bản gel. Ủ các mảnh

giấy lọc và miếng xốp trong dung dịch đệm 10 phút. Ủ màng PVDF trong

methanol trong 1 phút.



- Xếp xen kẽ bản gel và màng PVDF giữa xốp và giấy theo thứ tự (cao

su/giấy/gel/màng/giấy/cao su) và kẹp chặt lại cùng với nhau đảm bảo khơng

có bọt khí lọt vào giữa gel và màng.

- Chuyển protein từ gel SDS-PAGE lên màng PVDF bằng dòng điện 200 mA, ở

40oC trong 2 giờ.

- Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 5 phút với TBS và cố định với 3%

BSA trong 2 giờ

- Ủ màng với T4 Antibody trong 3% BSA ở 40oC từ 14 đến 16 giờ.

- Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 10 phút với TBST.

- Ủ màng với HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG trong 3% BSA trong 2h.

- Rửa màng PVDF 3 lần mỗi lần rửa khoảng 10 phút với TBST.

- Sử dụng kit DAB để hiện màu.

2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng

nguyên tái tổ hợp

a, Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp

trên thỏ. Thí nghiệm được bố trí như sau:

Thỏ thí nghiệm có khối lượng từ 1,8- 2 kg, thỏ khỏe sạch bệnh và được

nuôi ổn định trong 1 tuần thì tiến hành gây miễn dịch bằng phương pháp tiêm.

+ Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh, khơng có kháng

thể đặc hiệu với NNV được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút

là 104 TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤

5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103

LD50 )

+ Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh được gây miễn dịch

với vi khuẩn E.coliBL21- pET32a+- T4 và kháng nguyên tái tổ hợp được pha

loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 (in vitro) hoặc gây nhiễm vào

cá mú con khối lượng ≤ 5 g (in vivo) bằng phương pháp tiêm.



+ Lơ thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với vi khuẩn E.

coli BL21- pET32a+- T4 và kháng nguyên tái tổ hợp pha loãng theo hệ số 10

được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút 10 4 TCID50 rồi hấp

phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương

pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103 LD50).

Phản ứng trung hòa NNV được thực hiện trên tế bào GS1 theo hướng

dẫn của Virology methods manual (Brian và cộng sự, 1996) [22]:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào

Bước 2 : Chuẩn bị vi rút

Bước 3: Trung hòa NNV cường độc với các loại huyết thanh ở 280C

sau 12h.

Bước 4 : Gây nhiễm trở lại dịch trung hòa vi rút lên tế bào GS1

Bước 5: Đánh giá kết quả

- Âm tính: Nếu các giếng phản ứng khơng có biểu hiện bệnh tích tế bào; các bể

ni cá thí nghiệm khơng có cá chết hoặc tỷ lệ chết nhỏ hơn 5%.

- Dương tính: tồn bộ các giếng phản ứng có bệnh tích tế bào ở tất cả các độ

pha lỗng huyết thanh; các bể ni cá thí nghiệm có cá chết, tỷ lệ chết ≥ 50%.

- Lơ thí nghiệm: ở các giếng có độ pha lỗng huyết thanh cao, tế bào phát triển

tốt, khơng có tế bào chết. Ở các giếng có độ pha lỗng huyết thanh thấp, có

dấu hiệu bệnh tích tế bào đến hiện tượng tan bào.

+ Các mẫu cá thí nghiệm có thể có các kết quả như sau:

Nếu cá thí nghiệm khơng chết hoặc tỷ lệ chết nhỏ hơn 5% có nghĩa dịch

vi rút không gây chết cá, trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với kháng

nguyên E. coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp nên đã sinh kháng

thể đặc hiệu để trung hòa được NNV cường độc.

Nếu các mẫu cá thí nghiệm bị chết, tỷ lệ chết ≥ 50% có nghĩa dịch vi rút

gây chết cá, trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với kháng nguyên E.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×