Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá



- Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin

phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh

trên cá mú

2.3.1.1



Phương pháp thu và xử lý mẫu

Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo OIE (2005) [15].

Đề tài đã thu được 51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở các



vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, Bình Thuận với

các biểu hiện: màu sắc cơ thể đen tối, mắt lồi, bơi bất thường không định

hướng. Mẫu cá bệnh được ký hiệu như sau:

- Mẫu thu tại Quảng Ninh, số lượng 8 mẫu ký hiệu từ QN1 đến QN8

- Mẫu thu tại Hải Phòng, số lượng 11 mẫu ký hiệu từ HP1 đến HP11

- Mẫu thu tại Nam Định, số lượng 11 mẫu ký hiệu từ NĐ1 đến NĐ11

- Mẫu thu tại Khánh Hòa, số lượng 9 mẫu ký hiệu từ KH1 đến KH9

- Mẫu thu tại Bình Thuận, số lượng 12 mẫu ký hiệu từ BT1 đến BT12 Xử

lý mẫu: Theo phương pháp của Hedge và cs (2003) [36], mẫu bệnh

phẩm được thu não và mắt. Nghiền các mô này trong dung dịch muối cân

bằng Hanks (HBSS) với tỉ lệ 1:10. Sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15

phút, ở 4oC. Dịch nổi được hút ra và lọc qua màng lọc 0,25 µm. Dịch lọc

được bảo quản trong tủ lạnh.

2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học

Sử dụng theo OIE, FAO (2005) [15], phương pháp này dùng để sàng

lọc mẫu cá bệnh thông qua sự biến đổi mô và mức độ gây bệnh tích tế bào

trên mơ mắt và mơ não.



Tỷ lệ cá nhiễm bệnh (có CPE) theo từng vùng thu mẫu được xác định bằng

cơng thức:



Quy trình thực hiện phương pháp mơ bệnh học được thể hiện ở hình 2.1:



Mẫu bệnh



Cố định mẫu



Đọc tiêu bản mẫu



Thẩm thấu



Nhuộm mẫu



Đúc khn



Cắt mẫu



Kết luận



Hình 2.1. Quy trình thực hiện phương pháp mơ bệnh học

Mẫu mô học được cố định bằng dung dịch Davidson’s với tỷ lệ mẫu vật

và hoá chất cố định là 1:10. Mẫu vật được xử lý theo phương pháp mô học

truyền thống qua các bước như ngâm tẩm praffin, cắt lát mỏng từ 4-5µm và

nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin và Eosin (H&E), Gram hoặc Giemsa. Tiêu

bản được đọc dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau để

chẩn đốn biến đổi cấu trúc mơ gan tuỵ và sự hiện diện của các loại mầm

bệnh trong mô.

2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào

Dùng phương pháp Q.W.Qin và cs (2006) [55]. Trước khi sử dụng, tế

bào GS1 được hoạt hóa với mơi trường Leibovitz’s (LB) có bổ sung 10%

huyết thanh bào thai bê (FCS) cho tới khi tế bào mọc thành lớp ở đáy chai với

độ bao phủ khoảng 90%. Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy trước khi lây

nhiễm dịch mẫu.



Mẫu bệnh phẩm được lây nhiễm trên tế bào GS1. Hút 1ml dịch mẫu để

láng hết trên toàn bộ bề mặt tế bào của chai nuôi 75 cm 2. Ủ chai nuôi từ 1 đến

2 giờ ở 27oC, bổ sung thêm môi trường LB chứa 10% FCS.

Mẫu đối chứng chỉ có tế bào GS1 và mơi trường LB chứa 10% FCS.

Tế bào được nuôi ở nhiệt độ 27oC, 5% CO2 và bắt đầu theo dõi CPE

mỗi ngày. Khi CPE đạt khoảng 90 - 95% thì thu dịch vi rút, ly tâm thu dịch

nổi có chứa vi rút ở 10000 vòng/phút trong 30 phút. Dịch vi rút được bảo

quản ở -18oC.

2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào nhiễm VNN bằng Kit RNeasy

Qiagen của hãng Qiagen, Mỹ.

1. Cho 250 µl dịch tế bào + 100 µl RNase-free water + 350 µl RLT buffer (chứa

guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5 ml, vortex trong 5 phút.

2. Bổ sung 250 µl ethanol (96-100%), đảo trộn nhẹ bằng pipet.

3. Hút 700 µl sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15

giây ở 4˚C, thu cột rồi đổ dịch.

4. Bổ sung 500 µl dung dịch RPE pha loãng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách,

ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4 ºC (rửa cột để loại bỏ tạp chất), thu

cột rồi đổ dịch.

5. Bổ sung 500 µl RPE buffer pha lỗng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách, ly

tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4˚C. Thu cột bỏ tube dưới.

6. Chuyển cột sang tube mới, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu cột tách

và bỏ tube.

7. Chuyển cột sang eppendorf 1,5ml có nắp. Bổ sung 30µl RNase-free water,

đóng nắp ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, thu được RNA tinh sạch.

8. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.



2.3.1.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

(Thực hiện theo kít RT-PCR one step của hãng Qiagen, Mỹ)

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA

theo nguyên lý của PCR. Đối với NNV, kỹ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai

đoạn: giai đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA

và giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết.

2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose

Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61].

Lấy một thể tích mẫu (chứa khoảng 1-2 μg DNA), trộn với loading sau đó tra

vào các giếng của gel. Chạy điện di ở hiệu điện thế 110 V, thời gian 20-30

phút. Lấy bản gel tráng rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại có

bước sóng λ=260 nm.

2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen:

Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61]

* Phương pháp tinh sạch DNA không sử dụng gel agarose.

- Trộn đều hỗn hợp: sản phẩm RT-PCR, Sodium acetate 3M (lượng

20% so với lượng sản phẩm RT-PCR), isopropanol (lượng bằng 80-100% so

với lượng sản phẩm RT-PCR). Đặt tube chứa hỗn hợp trên ở -20 oC trong 25

phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn (sản phẩm RT-PCR kết

tủa). Rửa với ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn.

Khi cồn khơ hết thì hòa sản phẩm vào 50 µl H2O, bảo quản ở -20oC.

* Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4.

- Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn

Thành phần phản ứng bao gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động

(1 μl): EcoRI (1 μl): pGEMT (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên

gel agarose 1% để kiểm tra kết quả.

- Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: Hỗn hợp phản ứng bao gồm các

thành phần: H2O (6 μl): T4 DNA (1 μl): pGEM-T Easy (1 μl): Ligate Buffer



(1 μl): T4 Ligase (1 μl). Thực hiện phản ứng trong tube đã thanh trùng, ủ

tube ở 160C trong 14 giờ. Sau đó bảo quản ở 40C.

* Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli

Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61]

a) Chuẩn bị tế bào khả biến với tế bào chủ là E. coliJM109 .

- Chủng vi khuẩn E. coliJM109 được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi

qua đêm ở 370C. Lấy một khuẩn lạc đơn vào 20ml môi trường LB lỏng, lắc

qua đêm ở 370C, 200 lần/phút.

- Chuyển 1ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp khoảng

3h đến khi OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch ni cấy sang ống ly tâm đã

giữ lạnh trên đá 15 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, ở 4 0C trong 10 phút rồi bỏ

dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn.

- Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vơ trùng để lạnh (hòa tan thật nhẹ

nhàng bằng pipette). Sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0C. Loại

bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào.

- Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0,1 M đã thanh trùng để lạnh, hòa nhẹ

nhàng, để trên đá lạnh khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 vòng/ phút

trong 10 phút ở 40C, loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào.

- Hòa tan tế bào vào 1 ml dung dịch CaCl2 0,1M có bổ sung 15% glycerol đã vô

trùng để lạnh, để trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn nhẹ nhàng, chia ra các ống

eppendorf mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -80oC.

b) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.

- Bổ sung 5 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào khả biến và để 30 phút trên đá

lạnh.

- Sốc nhiệt 420C trong 45 giây, giữ trên đá 3 phút. Sau đó bổ sung 500 µl mơi

trường LB lỏng và ni lắc ở 370C trong 1 giờ.

c) Chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp sàng lọc xanh

- trắng.



- Cấy trang 100 μl hỗn hợp biến nạp trên môi trường LB rắn có bổ sung

Ampicillin (100 µg/ml), X-gal, IPTG. Nuôi trong tủ ấm 37 0C thời gian từ 14

đến 16 giờ.

- Tồn bộ khuẩn lạc phát triển trên mơi trường có ampicillin đều là khuẩn lạc

mang vector plasmid. Những khuẩn lạc xanh khơng có đoạn gen được xen

vào. Lựa chọn khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp trên vi khuẩn E. coli

* Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli

Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61]

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB đặc và nhân lên đến cuối giai

đoạn log. Tế bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh, plasmid được

thu lại bằng cách tủa với ethanol.

- Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 6 phút, 4oC. Loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào.

- Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ nhàng bằng pipette.

- Bổ sung 400 µl Solution II, đảo thật nhẹ nhàng.

- Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ nhàng đến khi xuất hiện kết tủa, để yên

khoảng 2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC, hút

500 µL dịch nổi vào eppendorf mới.

- Bổ sung 500 µl isopropanol vào eppendort chứa dịch, ly tâm 10.000

vòng/phút, 4oC. Loại bỏ dịch thu cặn chính là DNA kết tủa.

- Bổ sung 1ml ethanol 70% vào eppendort chứa cặn, ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 10 phút, 4oC, bỏ dịch thu cặn, thực hiện 2 lần liên tục như thế.

- Khi cồn khơ hết, bổ sung H2O để hòa tan DNA và bảo quản ở -200C. Sản

phẩm tách được kiểm tra trên gel agarose 0,8%.



* Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp.

Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm

tra bằng enzyme giới hạn và phản ứng PCR.

a) Phản ứng PCR master mix.

- Thành phần:

Thành phần phản ứng



Nồng độ



Master mix

H2O



Thể tích (µl)



2X



25



-



22



Primer 1



0,5



Primer 2



0,5



Plasmid tái tổ hợp



2



Tổng số



50



- Chu kỳ nhiệt của phản ứng: 94 oC trong 7 phút, 94oC trong 45 giây,

60oC trong 45 giây, 72oC trong 50 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72 oC trong

5 phút cho kết thúc ở vòng cuối cùng.

b) Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn.

 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI

Phản ứng cắt bằng EcoRI để kiểm tra sự có mặt của T4. Thành phần

phản ứng gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động (1 μl): EcoRI (1 μl):

pGEM-T (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để

kiểm tra kết quả.

*



Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose.



Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành

tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA

Cloning Kit của hãng Invitrogen:

1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn.

2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 10: 60

(mg/ µl) trong ống vơ trùng 5ml.



3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy

hết.

4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C.

5. Hút 400 µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc.

6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer vào cột, trộn đều rồi ủ ở

nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía

dưới.

7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5

phút.

8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột

tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml.

9. Bổ sung 50 µl TE buffer vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

10.



Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh



sạch, thu các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C

* Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

Gen T4 trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy

giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình

được thực hiện theo bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing. Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương

đồng của trình tự gen T4 thu được với các trình tự của GenBank.

2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử

thần kinh (NNV)

2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1

- Độc lực của vi rút được xác định bằng phương pháp chuẩn độ trên

đĩa nhựa 96 giếng.

Trước khi chuẩn độ 1 ngày, đĩa nhựa 96 giếng được cấy mỗi

giếng khoảng 7x104 tế bào GS1. Dịch vi rút được tiến hành pha

lỗng từ 10-1 đến 10-9 với mơi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS).

- Mỗi độ pha loãng cấy vào 4 giếng, mỗi giếng cấy 0,1 ml dịch vi rút.

Giữ khay đã cấy ở nhiệt độ 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Sau



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×