Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá

Tải bản đầy đủ - 0trang

- Yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng sức khỏe và khả năng

đáp ứng miễn dịch của cá. Vì vậy cần quan tâm cho cá ăn đủ chất, đủ lượng

khơng chỉ trong suốt q trình ni, mà cần đặc biệt quan tâm trước và sau

khi sử dụng vắc-xin nhằm tạo điều kiện cho hệ miễn dịch của cá đạt mức cao

nhất.

- Sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất tùy tiện khơng chỉ ảnh hưởng đến tình

trạng sức khỏe cá mà còn trực tiếp ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn

dịch ở cá. Ví dụ như việc sử dụng thuốc oxytetracycline có thể làm giảm đến

90% khả năng đáp ứng miễn dịch của cá. Vì vậy trước và sau khi sử dụng

vắc-xin không nên dùng thuốc kháng sinh để giảm khả năng sinh đáp ứng

miễn dịch ở cá.

1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới

Trên thế giới, hiện có 6 loại bệnh trên cá do vi rút nhân RNA gây ra bao

gồm vi rút gây thiếu máu ở cá hồi họ Orthomyxoviridae (ISAV), vi rút gây

hoại tử cơ quan tạo máu họ Rhabdoviridae (IHNV), vi rút trong máu cá chép

vào mùa xuân (SVCV), vi rút gây xuất huyết (VHSV), vi rút gây hoại tử thần

kinh họ Nadoviridae (NNV) và vi rút gây hoại tử tuyến tụy họ Birnaviridae

( IPNV). Ngoài ra có 5 loại bệnh do vi rút nhân DNA gây ra cho cá bao gồm

vi rút gây hoại tử xuất huyết họ Iridoviridae (EHNV), iridovirus trên cá vền

biển (RSIV), iridovirus trên cá tầm trắng (WSIV), Herpesviridae

Oncorhynchus masou virus (HOMV), vi rút trên cá Hồi Salmonid herpesvirus

2 (SaHV2) và herpesvirus gây bệnh trên cá da trơn (CCHV) (OIE, 2005) [15].

Hiện nay trên thế giới đã có một số loại vắc-xin vơ hoạt có nguồn gốc

từ vi rút được sử dụng để phòng các bệnh như hoại tử tuyến tụy (IPNV), hoại

tử cơ quan tạo máu (IHNV), nhiễm trùng xuất huyết (VHSV), vi rút đường

máu cá chép vào mùa xuân (SVCV). Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi rút trên tế bào

thường chi phí cao, khả năng tinh khiết khó vì vậy chi phí sản xuất vắc-xin

thường đắt và khơng được lựa chọn. Gần đây, sử dụng công nghệ DNA tái tổ

hợp để sản xuất vài loại vắc-xin protein từ vi rút để phòng bệnh cho cá rất khả

thi và đưa lại hiệu quả kinh tế cao (Christie và cs, 1997; Lorenzen và cs,

2005) [26][43].



Một loại vắc-xin lý tưởng phải có thời gian bảo hộ dài đối với cá; cách

sử dụng đơn giản như các phương pháp ngâm, tắm hoặc cho ăn; an toàn cho

cả cá và người sử dụng; mang lại lợi ích cho cả người ni cá và nhà sản xuất

vắc-xin. Hơn nữa, nhu cầu của người tiêu dùng toàn cầu đối với các nguồn

protein động vật, nhất là từ cá đang khơng ngừng tăng lên, đòi hỏi thực tiễn

nghề nuôi cá phải bền vững. Người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến an tồn

thực phẩm, có phản ứng tiêu cực đối với việc sử dụng kháng sinh phòng và trị

bệnh cho các lồi cá ni. Vì vậy việc sử dụng vắc-xin được coi là biện pháp

phòng bệnh rất tốt bởi nó hồn tồn khơng gây ra tác hại đối với môi trường

và sức khỏe người tiêu dùng.

Trên thế giới, cá hồi là đối tượng nuôi thu hút nhiều nghiên cứu về

cơng nghệ vắc-xin nhất bởi đây là lồi cá có giá trị kinh tế cao, sản lượng lớn

và được nuôi tập trung với quy mô công nghiệp.

Năm 1998, lần đầu tiên vắc-xin trộn vào thức ăn phòng bệnh cho cá hồi

mới được giới thiệu ở Nhật Bản. Năm 2005, vắc-xin DNA cho cá hồi được áp

dụng tại Canada. Sử dụng vắc-xin phòng bệnh đã làm giảm đáng kể việc dùng

thuốc kháng sinh trong các trang trại nuôi cá hồi công nghiệp ở Đại Tây

Dương (Lorenzen và cs, 2005) [43].

Ở Châu Âu, các trang trại nuôi đã sử dụng một số loại vắc-xin DNA để

phòng bệnh do vi rút gây ra trên cá hồi. Các bệnh trên cá hồi đã được kiểm

soát như hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV (Infectious haematopoetic

necrosis virus), nhiễm trùng máu xuất huyết do VHSV (viral haemorrhagic

septicaemia virus), hoại tử tuyến tụy do IPNV (infectious pancreatic necrosis

virus). Vắc-xin DNA được tạo ra từ protein tái tổ hợp thông qua sự biểu hiện

từ vi khuẩn E. coli. Protein tái tổ hợp VP2 từ IPNV được phối trộn với chất

bổ trợ nhũ dầu để tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử tuyến tụy cho cá hồi Đại

Tây Dương (Christie và cs, 1997) [26]. Trong điều kiện thực nghiệm vắc-xin

từ protein tái tổ hợp cũng có hiệu quả phòng bệnh cho cá chim Đại Tây

Dương do AHNV (Atlantic halibut nodavirus) gây ra (Sommerset và cs, 2005)

[64]. Tuy nhiên đối với vắc-xin protein tái tổ hợp thì hiệu quả phòng



bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do VHSV và bệnh hoại tử cơ quan tạo máu

do IHNV gây ra còn hạn chế và chưa đạt yêu cầu (Lorenzen và cs, 2005) [43].

Một số nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện của gen mã hóa protein như

luciferase, ᵦ-galactosidase để nghiên cứu mức độ biểu hiện ở các điều

kiện khác nhau, sự phân chia tế bào, thời gian biểu hiện và khả năng tạo phản

ứng miễn dịch (Anderson và cs, 1996; Heppell và cs, 2000; Russell và cs,

2000) [16][37][60]. Gần đây, các nghiên cứu về vắc-xin DNA chứa gen mã

hóa kháng nguyên từ chính tác nhân gây bệnh đã được thực hiện nhằm đánh

giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch để phòng các bệnh nguy hiểm cho



(Lorenzen và cs, 2005; Pasnik và cs, 2005; Purcell và cs, 2004) [43][52][54].

Theo một số báo cáo khoa học, protein vỏ tái tổ hợp được biểu hiện ở

E. coli hoặc tiểu phần của vi rút trong hệ thống biểu hiện của baculovirus đã

cung cấp một phần miễn dịch kháng lại bệnh hoại tử thần kinh trên cá (Tanaka

và cs, 2001)[65]. Do đó sử dụng vắc-xin được xem là phương pháp hữu hiệu

để kiểm soát bệnh do NNV gây ra.

Vắc-xin DNA mới được sử dụng để phòng bệnh cho cá, qua q trình sử dụng

cho thấy loại vắc-xin này có nhiều ưu điểm thuận lợi và một số tồn tại được

trình bày ở bảng 1.3.

Bảng 1.3. Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA

(Nguồn: Lorenzen và cs, 2005) [43].

Thuận lợi

Nguyên lý chung đơn giản

Mức độ an tồn cao

Kích hoạt cả cơ chế miễn dịch dịch

thể và tế bào



Tồn tại

Khơng có hiệu quả với tất cả mầm bệnh

Công nghệ mới cho nên khả năng bảo

hộ lâu dài cần phải nghiên cứu thêm

Không phân biệt rõ ràng với sinh vật



biến đổi gen (GMO)

Hiệu quả tốt và có thể áp dụng ngay Dư luận xã hội từ GMO có ảnh hưởng

từ giai đoạn sớm

đến sử dụng vắc-xin DNA

Độ ổn định và tinh khiết cao

Giá thành thấp, dễ sản xuất, chất

lượng đảm bảo



Vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh phải có hiệu quả ở giai đoạn phát

triển sớm của cá. Do ấu trùng cá mú kích thước nhỏ, mật độ cao cho nên việc

dùng vắc-xin trộn vào thức ăn là phương pháp phù hợp. Tuy nhiên, hạn chế

của phương pháp là kháng nguyên có thể bị ảnh hưởng bởi dịch tiêu hóa của

đường ruột. Vì vậy có vài phương pháp dùng vắc-xin trộn vào thức ăn được

cải tiến như đưa vắc-xin vào artemia sống và sử dụng artemia làm thức ăn cho

cá ở giai đoạn ấu trùng (Lorenzen và cs, 2005) [43].

Nghiên cứu của Tanaka và cs (2001) [65] cho thấy khi tiêm liều 60 µg

protein tái tổ hợp được biểu hiện trên E. coli vào cá mú bảy vạch E.

septemphasciatus thì nồng độ kháng thể trong máu cá tăng lên. Kết quả tương

tự cũng đạt được ở cá mú chuột (Cromileptes altivelis) khi tiêm lặp lại 3 liều,

mỗi liều chứa 70 µg hỗn hợp 3 protein tái tổ hợp vỏ NNV, mỗi lần cách nhau

10 ngày.

Trên cá mú chấm nâu (E. coioides) sau 7 ngày tiêm vắc-xin kháng

nguyên NNV đã có phản ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu với tỷ lệ sống

ở cá đạt từ 64,2% đến 69,5%. Ở cá mú chấm nâu sau khi được tắm vắc-xin

bất hoạt với ethyllen và formalin đạt tỷ lệ sống tương ứng từ 79 đến 95% và

từ 39 đến 43% (Lorenzen và cs, 2005)[43].

Ở cá mú nghệ (E. lanceolatus) sau khi gây miễn dịch với tạo hạt giả vi

rút VLPs (virus-like particles) của GNNV 2 liều, mỗi liều 100 µg cho thấy

trong 3 tuần đạt hiệu giá kháng thể cao với tỷ lệ sống của cá đạt từ 29% đến

38% (Lorenzen và cs, 2005)[43]. Cá mú chấm nâu (E. coioides) hiệu giá

kháng thể trung hòa đạt cao nhất sau khi tiêm 5 tháng (Kai và cs, 2010) [40].

Cá mú cọp (E. fuscoguttatus) khi dùng vắc-xin bất hoạt bằng formalin

đã nâng cao đáng kể tỷ lệ sống của cá. Kết quả sau 75 ngày dùng vắc-xin thì

kháng thể trung hòa giảm đi 3 lần so với sau 15 ngày (Pakingking và cs,

2010) [51].

Tại Nhật Bản, năm 2012 Nishizawa và cs đã chứng minh tiềm năng sử

dụng vắc-xin sống để phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú bảy sọc E.

septemphasciatus khi nuôi cá ở điều kiện nhiệt độ thấp (17oC). Cá thí nghiệm



được ngâm vắc-xin sống của NNV có tác dụng phòng bệnh rõ rệt so với lơ

đối chứng, cá đạt tỷ lệ sống là 93,3% (Nishizawa và cs, 2012)[49].

Hiện nay trên thế giới đã và đang sử dụng một số loại vắc-xin phòng

bệnh cho cá mú được thống kê trong bảng 1.4.

Bảng 1.4. Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

Loại vắcxin



Ký chủ



Giai

đoạn



Cách

dùng



Liều

dùng



Thời

gian

bảo

hộ



Nguồn tham

khảo



Protein vỏ

của GNNV



E. akaara



TTT



In vitro



0,1 ml



8 tuần



Lai và cs, 2001

[42]



Bất hoạt

formalin



E. lanceolatus



TTT



Tiêm cơ



TCID50 =

10-7



7 ngày



Lorenzen và cs,

2005 [43]



Vắc-xin

DNA



E .lanceolatus



TTT



Tiêm cơ



TCID50 =

10-7



7 ngày



Lorenzen và cs,

2005 [43]



VLPs



E. lanceolatus



Cá giống Tiêm cơ 10-100 µg 2 tuần



Lorenzen và cs,

2005 [43].



Tái tổ hợp



E. coioides



ấu trùng



Cho ăn



TCID50 = 35 ngày Lorenzen và cs,

2005 [43].

10-7



Bất hoạt

formalin



E. coioides



ấu trùng



Tắm



TCID50 = 30 ngày Kai và cs, 2010

[40]

10-7



Bất hoạt

formalin



E. fuscogutatus



TTT



Tiêm cơ



0,1 ml



E. septemfasciatus



TTT



Ngâm



TCID50 =

10-7



Sống



75 ngày



Pakingking và cs,

2010 [51]

Nishizawa và cs,

2012 [49].



(TTT: Tiền trưởng thành)

1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam

Thủy sản là ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam trong đó nghề ni

cá đang gặp nhiều khó khăn do dịch bệnh gây ra. Để kiểm soát dịch bệnh trên

cá nhiều biện pháp đã và đang được áp dụng như cải tạo ao đầm tạo môi

trường nuôi sạch, chọn cá giống sạch bệnh, áp dụng chế độ dinh dưỡng hợp lý

nhằm tăng sức đề kháng… nhưng hiệu quả nuôi cá vẫn chưa cao và dịch bệnh



vẫn thường xảy ra. Vì vậy, việc sản xuất và sử dụng vắc-xin để phòng dịch

bệnh cho cá ni có ý nghĩa rất lớn.

Việt Nam hiện đã có một số cơng trình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin

trong ni trồng thủy sản. Năm 1996 - 1998, Bùi Quang Tề và cs đã chế tạo

vắc-xin từ vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ,

vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ từ 90 đến 100% (Bùi Quang Tề và cs, 2006) [7]. Năm

2003, Vũ Dũng Tiến đã chế tạo vắc-xin từ sự kết hợp giữa kháng nguyên

ngoại bào và nội bào của vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho

cá trắm cỏ, vắc-xin đã có hiệu quả tốt với tỷ lệ bảo hộ đạt 100% (Vũ Dũng

Tiến và cs, 2003) [9]. Năm 2003 - 2005 đề tài KC-06-20NN đã chế tạo được

vắc-xin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng (đốm trắng) cho cá tra và cá

basa. Vắc-xin đảm bảo được chỉ tiêu an tồn trên cá thí nghiệm và tỷ lệ bảo

hộ đạt từ 90 - 100% (Bùi Quang Tề và cs, 2006) [7].

Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã triển khai

đề tài nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypothalmus) nuôi công

nghiệp ở đồng bằng Sông Cửu Long. Kết quả bước đầu cho thấy khả năng

đáp ứng miễn dịch ở cá tra đối với vi khuẩn E. ictaluri qua hàm lượng kháng

thể có trong máu cá đạt cao. Nồng độ kháng nguyên kết hợp sử dụng chất bổ

trợ Aluminum cũng được xác định (3.10 9 tế bào/cá) với phương pháp tiêm

vắc-xin 2 lần cách nhau 14 đến 15 ngày. Thời gian phòng bệnh cho đàn cá có

thể kéo dài đến 2 tháng. Ngồi ra, cũng cần phải thực hiện thêm những nghiên

cứu về độ an toàn của vắc-xin, nghiên cứu thay thế chất bổ trợ Aluminum

bằng chất chuyên dùng cho cá, đồng thời cải tiến phương pháp dùng vắc-xin

để có thể dễ dàng đưa vắc-xin phòng bệnh đốm trắng cho cá tra áp dụng vào

thực tế (Nguyễn Thị Biên Thuỳ, 2006) [8].

Như vậy ở Việt Nam các nghiên cứu về sử dụng vắc-xin cho cá còn rất

ít và chủ yếu là dùng vắc-xin vơ hoạt, vắc-xin độc lực yếu để phòng bệnh do

vi rút, vi khuẩn trên một số đối tượng cá nuôi nước ngọt như cá trắm cỏ, cá

tra, cá basa. Mặc dù tỷ lệ cá được phòng bệnh đạt trên 90% nhưng các báo



cáo cũng chưa đề cập đến khoảng thời gian kéo dài miễn dịch mà cá được

phòng bệnh.

Từ năm 2011, Phạm Thị Tâm và cs đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu phương pháp phát hiện vi rút gây bệnh và sản xuất vắc-xin

phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công nghiệp”. Là đối tượng

nuôi có giá trị kinh tế cao, nhưng cá mú lại rất mẫn cảm với bệnh hoại tử thần

kinh, vì vậy việc nghiên cứu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá là có ý

nghĩa thực tiễn. Sản phẩm từ đề tài là vắc-xin vô hoạt bằng formalin nồng độ

0,03% ở 4oC trong thời gian 5 ngày; lựa chọn được chất bổ trợ là dầu

Montanique ISA70 có khả năng tăng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch

phù hợp với cá mú trong điều kiện thí nghiệm. Vắc-xin đã có tác dụng phòng

bệnh cho cá mú, hiệu lực bảo vệ trên 83% cá giống, an tồn 100%, có độ vơ

trùng tuyệt đối (Phạm Thị Tâm và cs, 2015) [6]. Bên cạnh vắc-xin vơ hoạt, đề

tài còn hướng đến là chế tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả

năng tạo kháng thể nhằm sử dụng làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin

thế hệ mới phòng bệnh cho cá mú.



CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1.



2.1.2.



Đối tượng nghiên cứu

-



Vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)



-



Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp



Vật liệu nghiên cứu

- Tế bào GS1 (lách cá mú) của hãng Sigma (Đức)

- Vector pGEM-T và vector pET32a+ của hãng Novagen (Mỹ).

- Chủng E. coliJM109 và E. coliBL21(DE3) của hãng HV Biotek.

- Enzyme EcoRI (Invitrogen)

- Kít RT-PCR one step (Quiagen của Mỹ), kít tinh sạch DNA Qick Gel

Extraction (Invitrogen), thang DNA và protein (Invitrogen).

- Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen)

- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus

fuscoguttatus) và mú chuột (Cromileptes altivelis) ở các kích cỡ khác nhau;

- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) giai đoạn cá bột, cá con (chiều dài từ

1,5 – 2 cm)

- Các loại môi trường, dụng cụ nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's, FCS,

kháng sinh, kháng nấm,…

- Các loại hóa chất tinh khiết cho xét nghiệm mơ bệnh học; các hóa chất sử

dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử của các hãng: Sigma, Bio-Basic,

Invitrogen, Biological bao gồm: IPTG, ampicilin, X-gal, agarose, EDTA,

SDS, cao nấm men, peptone, NaCl, Ethidium Bromide, Ethanol, Isopropanol,

Sodium acetate, acid acetic, glycine, methanol, TBST, BSA, TBS, Tris HCl,

EDTA, TAE, NaOH, T4 ligase…



2.2. Nội dung nghiên cứu

- Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá



- Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin

phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh

trên cá mú

2.3.1.1



Phương pháp thu và xử lý mẫu

Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo OIE (2005) [15].

Đề tài đã thu được 51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở các



vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, Bình Thuận với

các biểu hiện: màu sắc cơ thể đen tối, mắt lồi, bơi bất thường không định

hướng. Mẫu cá bệnh được ký hiệu như sau:

- Mẫu thu tại Quảng Ninh, số lượng 8 mẫu ký hiệu từ QN1 đến QN8

- Mẫu thu tại Hải Phòng, số lượng 11 mẫu ký hiệu từ HP1 đến HP11

- Mẫu thu tại Nam Định, số lượng 11 mẫu ký hiệu từ NĐ1 đến NĐ11

- Mẫu thu tại Khánh Hòa, số lượng 9 mẫu ký hiệu từ KH1 đến KH9

- Mẫu thu tại Bình Thuận, số lượng 12 mẫu ký hiệu từ BT1 đến BT12 Xử

lý mẫu: Theo phương pháp của Hedge và cs (2003) [36], mẫu bệnh

phẩm được thu não và mắt. Nghiền các mô này trong dung dịch muối cân

bằng Hanks (HBSS) với tỉ lệ 1:10. Sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15

phút, ở 4oC. Dịch nổi được hút ra và lọc qua màng lọc 0,25 µm. Dịch lọc

được bảo quản trong tủ lạnh.

2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học

Sử dụng theo OIE, FAO (2005) [15], phương pháp này dùng để sàng

lọc mẫu cá bệnh thông qua sự biến đổi mô và mức độ gây bệnh tích tế bào

trên mơ mắt và mơ não.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×