Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
- Mã định danh họ gene NF-YB ở sắn được thu thập từ nghiên cứu trước (Chu Đức Hà và cs., 2017b).

- Mã định danh họ gene NF-YB ở sắn được thu thập từ nghiên cứu trước (Chu Đức Hà và cs., 2017b).

Tải bản đầy đủ - 0trang

Hình 2.2. Cơ sở dữ liệu Expasy

- Phân tích số liệu Excel.

2.2.2. Phương pháp dự đốn yếu tố điều hòa cis- trên vùng promoter của

gene mã hóa NF-YB ở sắn

- Mã định danh họ gene NF-YB ở sắn được thu thập từ nghiên cứu

trước (Chu Đức Hà và cs., 2017b).

- Vùng trình tự 1000 bp trên vùng promoter của các gene mã hóa

NF-YB ở sắn được thu thập trên Phytozome (Goodstein et al., 2012).

- Yếu tố điều hòa cis- (cis- regulatory element, CRE) được dự đốn

bằng cơng cụ PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/)

(Lescot et al., 2002).



Hình 2.3. Cơ sở dữ liệu PlantCARE

- Các CRE được tìm kiếm và có thể phân loại theo chức năng thành 4

nhóm chính, bao gồm nhóm CRE liên quan đến phản ứng ánh sáng ở cây,

nhóm CRE có liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở các mơ, nhóm CRE

đáp ứng với hormone và nhóm CRE đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi.

- Phân tích số liệu Excel để dự đốn các CRE đáp ứng hormone và điều

kiện ngoại cảnh bất lợi trên vùng promoter của gene mã hóa NF-YB ở sắn.



Khóa luận tốt nghiệp



27



Lê Hoàng Thu Phương – D – CNSH4A



Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Nông học



Khoa



Bảng 2.2. Một số CRE cơ bản

STT



Tên



Trình tự

bảo thủ



1



Hộp CAAT



CAAAT



2



Hộp TATA



TATAAT



3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13



Hộp I

Hộp G

ABRE

ERE

GARE

AURE

SARE

MeJARE

HSE

LTRE

Trình tự lặp giàu TC



14



MBS



AAGATAAGGCT

CACGTC

GAACCGTGGC

ATTTCAAA

AAACAGA

AACGAC

CCATCTTTTT

CGTCA

AGAAAATTCG

CCGAAA

ATTTTCTTCA

CAACTG



Chức năng

Cung cấp vị trí gắn cho RNA polymerase

Giúp cho q trình gắn RNA polymerase chính xác

vào vị trí khởi đầu phiên mã

Một phần của yếu tố đáp ứng ánh sáng

Yếu tố liên quan đến phản ứng với ánh sáng

Yếu tố đáp ứng abscisic acid

Yếu tố đáp ứng ethylene

Yếu tố đáp ứng gibberellin

Yếu tố đáp ứng auxin

Yếu tố đáp ứng salicylic acid

Yếu tố đáp ứng methyl jasmonate acid

Yếu tố đáp ứng với điều kiện nóng

Yếu tố đáp ứng với điều kiện lạnh

Yếu tố liên quan đến trình tự lặp giàu TC

Yếu tố liên quan đến vị trí bám của MYB - đáp ứng

với điều kiện hạn



ABRE: Abscisic acid responsive element, ERE: Ethylene responsive element, GARE: Gibberellin responsive element, AURE: Auxin responsive element, SARE: Salicylic acid

responsive element, MeJARE: Methyl jasmonate acid responsive element, HSE: Heat stress element, LTRE: Low temperature responsive element, MBS: MYB binding site.



Khóa luận tốt nghiệp

CNSH4A



28



Lê Hồng Thu Phương – D –



2.2.3. Phương pháp xây dựng cây phân loại của họ tiểu

phần NF-YB ở sắn

- Dự đoán chức năng của tiểu phần NF-YB ở sắn được dựa trên sự

biểu hiện gene và sự tương đồng với các protein đã biết có khả năng chịu

hạn của đậu tương gồm GmNF-YB01, GmNF-YB02, GmNF-YB04,

GmNF-YB09, GmNF-YB15, GmNF-YB19, GmNF-YB24, GmNF-YB27,

GmNF-YB32 (Quach et al., 2015) và A. thaliana AtNF-YB01 (Nelson et

al., 2007).

- Bắt cặp trình tự của các protein MeNF-YB từ sắn, đậu tương và

cây A. thaliana được thực hiện với bẫy khoảng trống là 10 và trị số gia tăng

khoảng cách là 0,2. Cây phân loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA

6.0 (Kumar et al., 2016), sử dụng phương pháp Neighbor-Joining.



Hình 2.4. Phần mềm MEGA 6.0

-



Mức độ tin cậy của các nhóm được ước tính bằng cách sử dụng



phân tích bootstrap là 1000 lần lặp lại. Giá trị bootstrap được hiển thị bên

cạnh các phân nhánh. Những thành viên của họ NF-YB ở sắn nếu được xác

định nằm cùng nhánh với NF-YB ở đậu tương và A. thaliana với giá trị

cut-off lớn hơn 50%.



Khóa luận tốt nghiệp



29



Lê Hồng Thu Phương – D – CNSH4A



2.2.4. Phương pháp phân tích dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa

NF-YB ở sắn

- Mã định danh của từng gene mã hóa NF-YB ở sắn được sử dụng để

truy cập vào dữ liệu microarray trong điều kiện thường (Wilson et al., 2017).

Toàn bộ hệ phiên mã transcriptomics của cây sắn đã được giải mã trên toàn bộ

của 11 mẫu mơ sắn (hình 2.5) thơng qua cơng cụ RNA-seq nhằm cung cấp

hiểu biết sâu sắc về sinh lý của cây sắn (Wilson et al., 2017).

- Dữ liệu biểu hiện của các gene thành viên họ gene NF-YB được

khai thác dựa trên nghiên cứu đã được công bố gần đây về ngân hàng biểu

hiện toàn bộ genome trên một số mẫu mô và cơ quan quan trọng trên cây

sắn (GEO accession: GSE82279).



Hình 2.5. Hình ảnh minh họa hệ phiên mã tiến hành

trên 11 mẫu mô sắn (Wilson et al., 2017).

- Trong nghiên cứu này, thông tin biểu hiện của các gene được tập

trung phân tích trên 7 bộ phận, bao gồm mô củ, rễ sợi, thân, chồi bên, lá,

gân lá và cuống lá (Wilson et al., 2017).

- Mức độ biểu hiện của các gene được mơ hình hóa bằng bản đồ nhiệt

trên cơng cụ Microsoft Excel.

Khóa luận tốt nghiệp



30 Hoàng Thu Phương – D – CNSH4A





CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân tích đặc tính protein của tiểu phần

NF-YB ở sắn

Mã định danh họ gene NF-YB ở sắn được thu thập từ nghiên cứu

trước (Chu Đức Hà và cs., 2017b). Trình tự amino acid của các protein NFYB được thu thập trên cơ sở dữ liệu Phytozome (Goodstein et al., 2012).

Một số đặc tính cơ bản của họ NF-YB ở sắn được khai thác và tìm kiếm

bằng cách tiến hành truy vấn trình tự protein vào cơng cụ tin sinh học.

Đặc tính của phân tử NF-YB, bao gồm kích thước phân tử, trọng

lượng phân tử, điểm đẳng điện, chỉ số bất ổn định và độ ưa nước được xác

định thông qua công cụ Expasy (Gasteiger et al., 2003). Công cụ Expasy là

cơ sở dữ liệu về hệ thống nghiên cứu phân tích cấu trúc phiên mã

(Gasteiger et al., 2003). Chính vì vậy, đây là cơ sở dữ liệu được hầu hết nhà

khoa học trên thế giới sử dụng để thu thập và khai thác các thông tin cơ bản

của phân tử protein, trong đó có kích thước phân tử, trọng lượng phân tử,

điểm đẳng điện, chỉ số bất ổn định và độ ưa nước của phân tử protein.

Từ kết quả thu thập được có thể giúp đánh giá kích thước, trọng

lượng phân tử, độ ưa nước, khả năng xuất hoặc nhập qua màng để thực

hiện một loạt chức năng điều hòa của các protein này trong tế bào. Qua đó

có thể đưa ra những dự đốn về vị trí cư trú của các protein này trong tế

bào. Kết quả phân tích về đặc tính của protein của tiểu phần NF-YB ở sắn

thu được ở bảng 3.1.

Nhìn vào bảng 3.1 có thể thấy, kích thước và trọng lượng của các

phân tử MeNF-YB khá nhỏ, chỉ từ 135 đến 243 amino acid. Nhìn chung

kích thước protein của họ gene MeNF-YB trung bình đạt 173 amino acid.

Protein MeNF-YB5 có kích thước nhỏ nhất, 135 amino acid; protein

MeNF-YB4 là phân tử lớn nhất, tương ứng với 243 amino acid. Nằm trong

khoảng trên 200 amino acid đến 243 amino acid 3 phân tử gồm MeNFYB4, MeNF-YB14 và MeNF-YB15. 14 phân tử MeNF-YB còn lại có kích

thước dưới 200 amino acid.

Khóa luận tốt nghiệp



31



Lê Hồng Thu Phương – D – CNSH4A



Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Nông học



Khoa



Bảng 3.1. Đặc tính của protein NF-YB ở sắn

STT



Tên protein



L (aa)



mW (kDa)



pI



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17



MeNF-YB1

MeNF-YB2

MeNF-YB3

MeNF-YB4

MeNF-YB5

MeNF-YB6

MeNF-YB7

MeNF-YB8

MeNF-YB9

MeNF-YB10

MeNF-YB11

MeNF-YB12

MeNF-YB13

MeNF-YB14

MeNF-YB15

MeNF-YB16

MeNF-YB17



172

156

140

243

135

161

179

195

154

141

177

174

161

201

207

182

158



19,45

17,41

15,77

26,76

15,24

18,26

19,78

21,88

17,44

16,13

19,44

18,85

17,78

20,77

23,28

20,11

17,78



5,53

4,69

5,17

8,99

4,73

6,33

6,32

5,65

6,32

5,51

6,10

5,65

9,05

6,38

5,67

4,98

5,82



Chỉ sớ

bất ổn định

45,27

51,53

51,51

55,79

61,50

53,46

40,13

43,06

42,45

39,79

38,76

43,30

45,29

35,81

52,85

35,70

46,30



GRAVY

-0,77

-0,53

-0,92

-0,59

-0,50

-0,83

-0,66

-0,62

-0,79

-0,85

-0,76

-0,66

-0,85

-0,66

-0,84

-0,89

-0,96



L (aa): Kích thước (amino acid), mW: Trọng lượng phân tử (kDa), pI: Điểm đẳng điện



Khóa luận tốt nghiệp

CNSH4A



32



Lê Hoàng Thu Phương – D –



Tỷ lệ thuận với kích thước protein, giá trị trọng lượng phân tử của họ

MeNF-YB cũng không đồng đều, dao động từ 15,24 kDa (MeNF-YB5) đến

26,76 kDa (MeNF-YB4), trong đó khoảng từ 15,24 kDa đến 19,78 kDa

gồm 12 phân tử là MeNF-YB1, MeNF-YB2, MeNF-YB3, MeNF-YB5,

MeNF-YB6, MeNF-YB7, MeNF-YB9, MeNF-YB10, MeNF-YB11,

MeNF-YB12, MeNF-YB13 và MeNF-YB17. Nằm trong khoảng 20,11 kDa

đến 26,76 kDa gồm 5 phân tử, bao gồm MeNF-YB4, MeNF-YB8, MeNFYB14, MeNF-YB15 và MeNF-YB16 (bảng 3.1). Qua những phân tích và

số liệu trên, cho thấy các phân tử MeNF-YB có kích thước và trọng lượng

khá nhỏ, cho thấy độ linh hoạt của các phân tử này, từ điều này có thể gợi ý

rằng các phân tử MeNF-YB có thể dễ dàng được xuất hoặc nhập qua màng

sinh học để thực hiện chức năng trong tế bào, tham gia điều hòa cũng như

đáp ứng với tác động của môi trường.

Mặt khác, giá trị điểm đẳng điện của một phân tử protein đã được

chứng minh có liên quan đến vị trí của protein đó trong tế bào, từ đó có thể

gợi ý chức năng của protein tham gia (Kiraga et al., 2007). Phân tích ba vị

trí dưới tế bào của các protein và thấy rằng trong plastid và proteome ty thể

của thực vật vẫn dư thừa một lượng protein có tính acid. Các tế bào chất và

các proteome màng bao gồm các protein có tính acid và protein cơ bản,

proteome hạt nhân có tỷ lệ tương đối của các protein có tính acid và protein

cơ bản. Các proteome có tính acid mạnh nhất hiện diện khơng chỉ ở tế bào

chất mà còn trong các khơng bào, lysosome và nhiều protein acid tạo thành

khung tế bào (Kiraga et al., 2007). Tóm lại protein có tính acid thường

được phân bố ở tế bào chất, trong ty thể và một số bào quan có màng

thường chứa protein có tính base. Kết quả cho thấy, các phân tử MeNF-YB

có giá trị pI ở trong khoảng từ 4,69 (MeNF-YB2) đến 9,05 (MeNF-YB13).

Các protein nằm trong khoảng từ 4,69 đến 6,38 có tính acid, bao gồm

MeNF-YB1, MeNF-YB2, MeNF-YB3, MeNF-YB5, MeNF-YB6, MeNFYB7, MeNF-YB8, MeNF-YB9, MeNF-YB10, MeNF-YB11, MeNF-YB12,

MeNF-YB14, MeNF-YB15, MeNF-YB16, MeNF-YB17. Các protein này

Khóa luận tốt nghiệp



33



Lê Hoàng Thu Phương – D – CNSH4A



sẽ được vận chuyển ra tế bào chất sau khi được tổng hợp trong nhân. Hai

protein MeNF-YB4 và MeNF-YB13 có pI khoảng base, do đó 2 phân tử

này có thể được bám trên ty thể hoặc các hệ thống có màng.

Tương tự, kích thước protein của họ gene NF-YB trên cây sắn cũng

tương đồng với họ gene NF-YB trên cây cam ngọt đã được ghi nhận trước

đó (Chu Đức Hà và cs., 2017a). Hầu hết kích thước protein của cam ngọt

đạt từ 78 (CsNF-YB12) đến 335 (CsNF-YB5) amino acid. Duy nhất

protein CsNF-YB1 có kích thước protein lớn hơn nhiều là 587 amino acid

so với các protein còn lại. Độ đẳng điện của họ NF-YB trên cam ngọt đạt từ

4,7 (CsNF-YB19) đến 9,7 (CsNF-YB1) gần giống với họ NF-YB trên sắn

(Chu Đức Hà và cs., 2017a).

Ngồi ra trong nghiên cứu này, chúng tơi quan tâm đến độ ưa nước

của các phân tử protein MeNF-YB. Các giá trị GRAVY của MeNF-YB đều

< 0, chứng tỏ rằng các tiểu phần MeNF-YB đều có tính chất ưa nước.

Trước đó, Ning Lei và cộng sự (2017) cũng đã phân tích giá trị GRAVY

của nhóm TF TCP ở sắn. Kết quả cho thấy, các giá trị GRAVY của họ

MeTCP đều < 0, đồng thuận với kết quả của nghiên cứu này (Ning Lei et

al., 2017).

Bên cạnh đó, chỉ số bất ổn định là một chỉ số của protein, được sử

dụng để xác định xem protein có ổn định trong ống nghiệm hay khơng. Nếu

chỉ số nhỏ hơn 40, thì protein đó ổn định trong ống nghiệm còn nếu lớn

hơn 40 thì protein đó khơng ổn định. Theo kết quả phân tích có 4 phân tử

protein MeNF-YB10, MeNF-YB11, MeNF-YB14 và MeNF-YB16 có chỉ

số bé hơn 40 chứng tỏ chúng ổn định trong ống nghiệm. Còn lại 13 phân tử

protein MeNF-YB là không ổn định trong ống nghiệm.

3.2. Kết quả phân tích yếu tố điều hòa cis- trên vùng

promoter của các gene mã hóa tiểu phần NF-YB ở sắn

Để bước đầu dự đốn chức năng và vai trò điều hòa của họ gene mã

hóa NF-YB ở sắn, CRE đã được tìm kiếm trong vùng promoter (1000 bp

trước vị trí mã mở đầu) của từng gene tương ứng. Các yếu tố điều hòa nằm

Khóa luận tốt nghiệp



34 Hồng Thu Phương – D – CNSH4A





trên promoter và cùng một sợi với vùng mã hóa của gene được gọi là các

CRE. Mỗi yếu tố được đặt tên trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng.

Một số yếu tố cơ bản, như hộp CAAT (CAAT-box) và hộp TATA

(TATA-box) đều được phân bố ở vùng promoter ở tất cả các gene MeNFYB. Các gene mã hóa protein có một trình tự nucleotide đặc trưng gọi là

hộp TATA. Hộp này chịu trách nhiệm giúp cho quá trình gắn RNA

polymerase chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã. Hộp TATA thường nằm

cạnh một CRE cơ bản khác đó là hộp CAAT cung cấp vị trí gắn cho RNA

polymerase (Lê Thị Thu Hiền và cs., 2007).

Tiếp theo, rất nhiều CRE có thể được phân loại theo chức năng thành

4 nhóm chính, bao gồm nhóm CRE liên quan đến phản ứng ánh sáng ở cây,

nhóm CRE có liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở các mô, nhóm

CRE đáp ứng với hormone và nhóm CRE đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh

bất lợi. Những kết quả này gợi ý rằng, họ gene NF-YB ở sắn có thể tham

gia vào phản ứng với điều kiện ánh sáng, sự biểu hiện của các gene này có

thể đặc trưng ở một hay một vài mơ/cơ quan trong cây và có thể đáp ứng

với hormone và điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Kết quả một số CRE liên

quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở mơ được dự đốn trong vùng

promoter của họ gene mã hóa NF-YB ở sắn được thể hiện ở bảng 3.2.

Kết quả cho thấy, hầu hết các gene họ MeNF-YB đều chứa 1 CRE

liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở 1 mô, cơ quan. Đặc biệt ở nội

nhũ có tới 9/17 promoter có mặt CRE. Rễ và lá chứa duy nhất 1 CRE xuất

hiện lần lượt ở MeNF-YB4 và MeNF-YB13. Có tới 8 promoter không chứa

CRE nào liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở mơ đó là MeNF-YB1,

MeNF-YB3, MeNF-YB9, MeNF-YB10, MeNF-YB11, MeNF-YB12, MeNFYB16, MeNF-YB17. Riêng MeNF-YB13 chứa các CRE liên quan đến biểu

hiện đặc thù ở 3 mô, cơ quan đó là meristem, nội nhũ, lá. Sự xuất hiện các

CRE liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở mơ được dự đốn trong

vùng promoter của họ gene mã hóa NF-YB ở sắn có thể liên quan đến sinh

trưởng và phát triển của sắn và đáp ứng với điều kiện bất lợi.

Khóa luận tốt nghiệp



35



Lê Hồng Thu Phương – D – CNSH4A



Bảng 3.2. Một số CRE liên quan đến mức độ biểu hiện đặc thù ở mơ

được dự đốn trong vùng promoter của họ gene mã hóa NF-YB ở sắn

STT



CRE mơ

Gene



1



MeNF-YB1



2



MeNF-YB2



3



MeNF-YB3



4



MeNF-YB4



5



MeNF-YB5



6



MeNF-YB6



7



MeNF-YB7



8



MeNF-YB8



9



MeNF-YB9



10



MeNF-YB10



11



MeNF-YB11



12



MeNF-YB12



13



MeNF-YB13



14



MeNF-YB14



15



MeNF-YB15



16



MeNF-YB16



17



MeNF-YB17



Meristem



Nội nhũ







Rễ



: Có mặt CRE



Tiếp theo, các CRE đáp ứng hormone được phát hiện trong vùng

promoter của họ gene NF-YB ở sắn, bao gồm: yếu tố đáp ứng với ABA

(ABRE); yếu tố đáp ứng ethylene (ERE); yếu tố đáp ứn gibberellin (GARE);

yếu tố đáp ứng methyl jasmonate acid (MeJARE); yếu tố đáp ứng salicylic

acid (SARE); yếu tố đáp ứng auxin (AURE) đã được tìm thấy trên vùng

promoter của hầu hết các gene mã hóa NF-YB ở sắn, kết quả được thể hiện ở

bảng 3.3.



Khóa luận tốt nghiệp



36 Hồng Thu Phương – D – CNSH4A





Trường Đại học Nông – Lâm Bắc Giang

Nông học



Khoa



Bảng 3.3. Một số CRE đáp ứng hormone được dự đoán trong vùng promoter của họ gene mã hóa NF-YB ở sắn

STT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17



CRE

Gene

MeNF-YB1

MeNF-YB2

MeNF-YB3

MeNF-YB4

MeNF-YB5

MeNF-YB6

MeNF-YB7

MeNF-YB8

MeNF-YB9

MeNF-YB10

MeNF-YB11

MeNF-YB12

MeNF-YB13

MeNF-YB14

MeNF-YB15

MeNF-YB16

MeNF-YB17



ABRE



ERE



GARE



MeJARE



SARE



AURE



ABRE: Yếu tố đáp ứng với ABA; ERE: Nhóm yếu tố có liên quan đến ethylene; GARE: Nhóm yếu tố liên quan đến gibberellin; MeJARE: Nhóm yếu tố liên quan đến methyl

jasmonate acid; SARE: Nhóm yếu tố liên quan đến salicylic acid; AURE: Nhóm yếu tố liên quan đến auxin;

: Có mặt CRE



Khóa luận tốt nghiệp

CNSH4A



37



Lê Hồng Thu Phương – D –



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

- Mã định danh họ gene NF-YB ở sắn được thu thập từ nghiên cứu trước (Chu Đức Hà và cs., 2017b).

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×