Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

Tải bản đầy đủ - 0trang

3.2 Cơ chế gây bệnh của A. tumefaciens

- Sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối

loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.

- Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật

theo ý muốn.



3.3. Nuôi cấy phát sinh mô sẹo (Callus)



- Là khối mô phát triển mạnh mẽ vô tổ chức trên hoặc xung quanh

bề mặt vết thương hay vết cắt; hoặc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.

- Thông thường, môi trường tạo mô sẹo cần bổ sung auxin ở nồng

độ cao, auxin có thể sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với cytokinin. Tuy

nhiên, đối với mẩu có nồng độ auxin nội sinh cao, khi khơng có sự bổ

sung của auxin ngoại sinh, mẫu cũng có thể phát sinh mơ sẹo.



4. BIẾN NẠP GEN Ở MƠ SẸO MÍA BẰNG VI KHUẨN

A. Tumefaciens VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN

4.1. Vật liệu:

- Chồi mía POJ (Proefstation Oast Java) in vitro thuộc lồi Saccharum

officinarum L. do Công ty Cổ phần đường Quảng Ngãi cung cấp được dùng làm

nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm.

- Mơi trường: Mơi trường MS (Murashige và Skoog (1962) bổ sung đường

sucrose (20 g/L), agar (8 g/L), nước dừa 10% và các chất khác nhau tùy theo từng

thí nghiệm.



4.2. Các thí nghiệm

4.2.1. Thí nghiệm khảo sát mơi trường thích hợp cho sự tạo sẹo

- Bố trí thí nghiệm:

Mơi trường cho thí nghiệm 1



- Mơi trường MS



+ 1 mg/L 2,4-D (D1)



- Đường Sucrose (20 g/L)



+ 2 mg/L 2,4-D (D2)



- Agar (8 g/L)

- Nước dừa 10%

- Polyvinylpyrrolidone (PVP) (0,8 g/L)



Chồi mía (2-3 mm)



+ 3 mg/L 2,4-D (D3)

+ 4 mg/L 2,4-D (D4)



MS bổ sung PVP



Để trong tối

o

22 – 25 C



- Kết quả:

+ Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy, các khúc cắt thân bắt đầu hình thành sẹo tại vị trí cắt gần với gốc (Bảng 1).

+ Sau 4 - 6 tuần, các mẫu mô sẹo trở nên rắn chắc và ngả sang màu vàng (Hình 1). Các mẫu thân khơng tạo sẹo thì đen dần và cuối cùng chết đi.



Nghiệm thức



Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%)



D1



a

55,56 ± 3,85



D2



b

64,44 ± 3,85



D3



c

91,11 ± 3,85



D4



d

75,56 ± 3,85



Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo sẹo



Hình 1. Mơ sẹo sau 6 tuần



4.2.2. Thí nghiệm khảo sát mơi trường thích hợp cảm ứng tạo chồi từ sẹo



- Bố trí thí nghiệm:

Mơi trường cho thí nghiệm 2

+ 0,0 mg/L BA (B0)

+ 0,5 mg/L BA (B0,5)



- Môi trường MS

- Đường Sucrose (20 g/L)

- Agar (8 g/L)

- Nước dừa 10%



+ 1,0 mg/L BA (B1)

+ 1,5 mg/L BA (B1,5)

+ 2,0 mg/L BA (B2)

+ 2,5 mg/L BA (B2,5)



Chiếu sáng 16h/ngày

3000 lux



Mô sẹo ở TN1 (2-3 mm)



MS bổ sung BA



Nghiệm thức



Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)



Số chồi / mẫu (chồi)



B0



c

5,56 ± 4,81



0–1



ab



B0,5



22,22 ± 4,81



B1,0



30,56 ± 4,81



B1,5



30,56 ± 4,81



B2,0



19,44 ± 4,81



B2,5



19 ,44 ± 4, 81



a

a



1

2–5

1–2



b

b



Bảng 2. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh chồi của sẹo mía



1

1

Hình 2. Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi từ sẹo sau 5 tuần nuôi cấy



- Sau 10 ngày, sẹo đặt trên các môi trường bắt đầu cảm ứng tạo chồi

- Sau 5 tuần ni cấy, các nghiệm thức có sự khác biệt về số chồi phát sinh từ một mẫu mô ban đầu



4.2.3. Thí nghiệm khảo sát nồng độ PPT tối thiểu gây chết 100% cho mơ mía

- Bố trí thí nghiệm:

Mơi trường cho thí nghiệm 3

+ 0 mg/L PPT (P0)



- Mơi trường MS

- Đường Sucrose (20 g/L)

- Agar (8 g/L)

- Nước dừa 10%

- Polyvinylpyrrolidone (PVP) (0,8 g/L)



+ 1 mg/L PPT (P0)

+ 2 mg/L PPT (P0)

+ 3 mg/L PPT (P0)

+ 4 mg/L PPT (P0)

+ 5 mg/L PPT (P5)



Để trong tối

o

(22 - 25 C)



Mô sẹo ở TN1(2-3 mm)



MS bổ sung PVP, PPT



-



Kết quả:



Các mẫu mơ sẹo đối chứng trên mơi trường khơng có PPT vẫn giữ nguyên màu sắc như ban đầu và phát triển tốt. Trong khi đó, các mẫu trên mơi trường có PPT

sau 1-2 tuần bắt đầu hóa vàng, nâu tùy theo nồng độ.



Nghiệm thức



Tỉ lệ mẫu sống (%)



P0



100,00 ± 0,00



P1



50,00 ± 8,33



P2



38 ,89 ± 4, 81



P3



36,11 ± 4,81



P4



16,67 ± 0,00



P5



0,00 ± 0,00



a



b

c

c

d

e



Bảng 3. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của sẹo mía



4.2.4. Thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh chồi sau chuyển gen

- Bố trí thí nghiệm

+ Chuẩn bị dịch khuẩn:



Dịch tạo sẹo ở nghiệm thức D3

Vi khuẩn A. tumefaciens

+ AS đến nồng độ 100μM và

Thu sinh khối



150μM

Lắc đều và để yên trong 30 phút



20 ml YEP lỏng

rifampicin 50 mg/l

kanamycin 50 mg/L



OD600 = 0,6–0,8



+ Ủ mẫu với dịch khuẩn:



15’ hoặc 30’



Thấm khô bằng giấy

thấm vô trùng trong

15’ hoặc 30’



Mô sẹo D3 ở TN1(2-3 mm)



Ngâm vào dịch

khuẩn đã chuẩn bị



Môi trường D3 của

TN1



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×