Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 0trang

FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind.

Co., Ltd.).

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết

hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của

Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là

TMS (Tetrametyl silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gờm:

• Phở cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

• Phở cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC và COSY

• Dung mơi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD hoặc CDCl3.

Phổ khối lượng

Phổ khối lượng được đo trên máy Agilent 1100 của Viện Hoá sinh biển, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Độ quay cực [α ]D

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện

Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro

• Nguyên liệu

Các hoạt chất được pha ở nồng độ gốc là 4 mg/ml trong DMSO 100%. Sau

đó, được pha lỗng để có nồng độ cuối cùng trong giếng thử là 100 µg/ml trong các

phép thử sàng lọc. Ở các phép thử xác định nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào

ung thư IC50, các mẫu được tiếp tục pha loãng 5 lần trong 4 lần liên tục để tạo loạt

nồng độ bằng DMSO 10%. Các dòng tế bào ung thư bao gồm: KB, LU-1, SK-Mel2,



27



P388, HepG-2, LNCaP, MCF-7, SW-480 do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học

Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

• Phương pháp ni cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường

nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L natri

bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngồi ra bở

sung 10% huyết thanh phơi bò FBS (GIBCO). Riêng mơi trường ni cấy tế bào

MCF-7 được bở sung Insulin ở nồng độ 40 µg/L.

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO 2

ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

• Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm

sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng

số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần

protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo

được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng

nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện

trong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử (10 μl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96

giếng để có nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml; 50 μg/ml; 25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 6,25

μg/ml.

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp 3x10 4 tế bào/giếng

(trong 190 μl môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-4 ngày.



28



Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190μl)

sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố

định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO 2, tế bào được cố định vào đáy giếng

bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở nhiệt độ 37°C. Đở

bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khơ

trong khơng khí ở nhiệt độ phòng.

Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered base Tris để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế

bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua cụng thc sau:



[ OD(chất thử)- OD(ngày 0)] ì 100



%sống sót =



OD(đối chứng â

m) - OD(ngày 0)



Cỏc phộp th c lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine

(Sigma) được sử dụng là chất đối chứng dương. DMSO 10% luôn được sử dụng đối

chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào

phần mềm máy tính TableCurve.



29



CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Xử lý mẫu nghiên cứu

Nguyên liệu: Mẫu hải miên H. varia được thu thập tại Cô Tô - Quảng Ninh

vào tháng 3 năm 2014.

Mẫu hải miên H. varia sau khi thu thập được rửa sạch nhiều lần bằng nước

để loại muối và tạp bẩn, được thái nhỏ sau đó ngâm chiết trong metanol.



Hình 3. Mẫu hải miên Haliclona varia thu thập tại Cô Tô

3.2. Phân lập các hợp chất

Mẫu Haliclona varia (1,5 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối sau đó thái nhỏ

(3 cm/đoạn) và ngâm chiết kết hợp siêu âm bằng metanol (5 L×3, 3h). Dịch chiết

được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được cặn metanol (HV, 53

g). Cặn này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố với

diclometan thu được cặn diclometan (HV1, 18 g) và dịch nước HV2 (30 g). Phần

cặn diclometan HV1 được hòa tan với một lượng tối thiểu diclometan sau đó tẩm

với silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến hành phân tách hỗn hợp này

bằng cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/axeton với độ



30



phân cực tăng dần (n-hexan/axeton, 100/0→0/1, v/v) thu được 3 phân đoạn HV1A

(3,5 g), HV1B (5 g) và HV1C (2 g). Phân đoạn HV1A sử dụng sắc ký cột silica gel

kết hợp với hệ dung môi rửa giải n-hexan/axeton (2,5/1, v/v) thu được 2 phân đoạn

HV1A1 (900 mg) và HV1A2 (450 mg).

Phân đoạn HV1A1 tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha đảo, hệ dung môi

rửa giải metanol/nước (1,5/1, v/v) thu được chất sạch 1 (14 mg), 3 (8 mg) và 4 (17

mg).

Hợp chất 5 (15 mg) thu được khi chạy sắc ký cột silica gel phân đoạn

HV1A2, hệ dung môi rửa giải n-hexan/etyl axetat (1/1, v/v).

Phần HV1B sử dụng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải

axeton/nước (2/1, v/v) thu được 2 phân đoạn HV1B1 (900 mg) và HV1B2 (500

mg). Tiếp tục phân tách HV1B2 bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng

hỗn hợp diclometan/axeton (6/1, v/v) thu được hợp chất 2 (14 mg) và hợp chất 6 (10

mg).

Hợp chất 7 (15 mg) thu được khi chạy phân đoạn HV1B1 trên cột sắc kí pha

đảo, hệ dung mơi rửa giải metanol/nước (1,5/1, v/v).



31



Hình 4. Sơ đờ phân lập các hợp chất từ loài hải miên H. varia

3.3. Các thơng số vật lí của các hợp chất đã phân lập

3.3.1. Hợp chất 1: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one

Bột vơ định hình màu trắng;

−78,0 (c 0,3, CHCl3);

Công thức phân tử: C27H44O2;

ESI-MS: m/z 401 [M+H]+;

1



H-NMR (CDCl3), 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 1.



3.3.2. Hợp chất 2: 22(E)-3β-hydroxycholesta-5,22-dien-7-one

Bột vơ định hình màu trắng;



32



[α ]25

D : −93,0 (c 0,2, CHCl3);



Công thức phân tử: C27H42O2;

ESI-MS: m/z 399 [M+H]+. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz);

13



C-NMR (CDCl3, 125 MHz): xem Bảng 2.



3.3.3. Hợp chất 3: 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene

Bột vơ định hình màu trắng;

[α ]25

D : -130,2 (c 0,2, CHCl3);



Công thức phân tử: C27H46O2;

APCI-MS: m/z 367 [M+H-2H2O]+;

1



H-NMR (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 3.



3.3.4. Hợp chất 4: 3β,7β-dihydroxycholest-5-ene

Bột vơ định hình màu trắng;

[α ]25

D : +30,0 (c 0,1, CHCl3);



Công thức phân tử: C27H46O2;

APCI-MS: m/z 367 [M+H-2H2O]+ ;

1



H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.



3.3.5. Hợp chất 5: 5α,8α-epidioxycholesta-6,9(11)-dien-3β-ol

Bột vơ định hình, màu trắng;

[α ]25

D : -31,0 (c 0,5, CH2Cl2);



Công thức phân tử: C27H42O2;

1



H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 5.



33



3.3.6. Hợp chất 6: 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol

Tinh thể hình kim, màu trắng;

Tnc: 102-103°C

[α ]25

D -31o (c 0.5, CH2Cl2)



Công thức phân tử: C27H44O3;

ESI-MS: m/z 439 [M+Na]+;

1



H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 6.



3.3.7. Hợp chất 7: solomonsterol A

Bột vô định hình, màu trắng;

[α ]25

D : +4,5 (c 0,8, MeOH);



ESI-MS: m/z 661 [M−Na]−, 639 [M−2Na+H]−, 617 [M−3Na+2H]−;

Công thức phân tử: C24H39Na3O12S3 ;

1



H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 7.



3.4. Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư in vitro của các hợp chất

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho 5 hợp chất với phương pháp nêu

trong mục 2.2.3.Tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với 5 mẫu

là 2, 3, 4, 5 và 7 trên 8 dòng tế bào ung thư người:

• Ung thư gan (HepG-2)



• Ung thư tuyến tiền liệt LNCaP



• Ung thư biểu mơ (KB)



• Ung thư da (SK-Mel-2)



• Ung thư phởi (LU-1)



• Ung thư bạch cầu (P388).



• Ung thư vú (MCF-7)



• Ung thư đại tràng (SW-480)



34



CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

4.1.1. Hợp chất 1: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one



Hình 5. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cơng thức

phân tử được dự đốn là C 27H44O2 dựa trên phổ ESI-MS với pic ion m/z 401 [M+H]+

kết hợp dữ liệu phổ 13C-NMR. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 cho tín hiệu của 5 nhóm

metyl: δH 0,68 (3H, s, H-18), 1,21 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21) và

0,87 (6H, d, J = 6,5 Hz, H-26, H-27), một proton oximetin tại δH 3,63 (1H, m, H-3)

và một proton olefin tại δH 5,67 (1H, s, H-6). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1

xuất hiện 27 tín hiệu cacbon, trong đó có 1 nhóm cacbonyl, 3 cacbon bậc bốn, 8

cacbon metin, 10 cacbon metilen và 5 cacbon metyl. Các dữ kiện phổ 1H- và 13CNMR của hợp chất 1 đề xuất về một khung cholestan có chứa nhóm cacbonyl và

liên kết đơi. Dựa trên các tài liệu tham khảo về các hợp chất sterol thuộc chi

Haliclona, hợp chất 1 được dự đoán là 3β-hydroxycholest-5-en-7-one [28]. Các

tương tác H-26/H-27 (δH 0,87) và C-24 (δC 39,47)/C-25 (δC 27,98); H-21 (δH 0,92) và

C-20 (δC 35,69); H-18 (δH 0,68) và C-12 (δC 38,71)/C-13 (δC 41,82)/C-14 (δC

49,95)/C-17 (δC 54,81); H-19 (δH 1,21) và C-1 (δC 36,36)/C-5 (δC 165,23)/C-9 (δC

49,97)/C-10 (δC 38,38) cho phép gắn nhóm metyl ở các vị trí C-10, C-13, C-20 và

C-25/C-25. Các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,63)/ C-5 (δC 165,23); H-8 (δH

2,22)/H-9 (δH 1,52)/C-7 (δC 202,34) khẳng định nối đơi và nhóm cacbonyl lần lượt ở

các vị trí C-5/C-6 và C-7 tương ứng. Nhóm hiđroxi ở C-3 được gán dựa vào tương



35



tác HMBC giữa H-4 (δH 2,42/2,52) và C-3 (δC 70,46). Do đó, hợp chất 1 được

khẳng định là 3β-hydroxycholest-5-en-7-one. Hợp chất này đã được phân lập từ loài

Haliclona sp. bởi Li và các cộng sự [22].



Bảng 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất tham khảo

C

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27



#



δC

36,5

31,3

70,6

41,9

165,2

126,3

202,4

45,5

50,1

38,4

21,3

38,8

41,9

50,1

26,4

28,6

54,9

12,1

17,4

35,8

19,0

36,3

23,9

39,6

28,1

22,6

22,9



δCa,b

36,36

31,16

70,46

43,10

165,23

126,05

202,34

45,41

49,97

38,38

21,21

38,71

41,82

49,95

26,31

28,52

54,81

11,96

17,30

35,69

18,86

36,18

23,82

39,47

27,98

22,54

22,79



δHa,c (mult., J = Hz)

1,21 (m)/1,95 (m)

1,62 (m)/1,94 (m)

3,63 (m)

2,42 (m)/2,52 (m)

5,67 (s)

2,22 (m)

1,34 (m)

1,58 (m)

1,14 (m)/2,02 (m)

1,52 (m)

1,25 (m)/2,41 (m)

1,28 (m)/1,88 (m)

1,08 (m)

0,68 (s)

1,21 (s)

1,41 (m)

0,92 (d, 6,5)

1,01 (m)

1,12 (m)/1,33 (m)

1,12 (m)

1,52 (m)

0,87 (d, 6,5)

0,87 (d, 6,5)



a



HMBC (H→C)

3, 5

4, 10



2, 3,5, 6

4, 8, 10

7

7, 11

9, 12, 13

17

16

13, 14, 17

15

13, 16

13, 14, 15, 17

1, 5, 9, 10

17, 20, 22



24, 25, 27

24, 25, 26



Đo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, #δC của 3β-hydroxycholest-5-en-7-one[28]



36



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×