Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
2 Phương pháp nghiên cứu

2 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ - 0trang

Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



2.2.2 Đánh giá khả năng lên men sữa

2.2.2.1 Khả năng lên men đường lactose:

Sau khi các chủng được hoạt hóa trên MRS dịch thể, tiếp tục ni cấy trên môi

trường dịch thể MRS dịch thay thế glucose bằng lactose (10g/l) và bổ sung thêm chất

chỉ thị red phenol (0,17g/l). Đổ 1ml dầu khống lên bề mặt mơi trường ni cấy để tạo

điều kiện kị khí. Các chủng LAB này được nuôi tĩnh ở 37 oC trong 24 – 48 giờ. Quan

sát dịch nuôi cấy, dấu hiệu vi khuẩn lên men sử dụng đường lactose là sự chuyển màu

từ đỏ sang vàng của môi trường nuôi cấy do axit sinh ra làm giảm pH làm thay đổi màu

của phenol red.

2.2.2.2 Thử khả năng lên men sữa

Các chủng LAB được nuôi tĩnh trên môi trường dịch thể MRS, nuôi cấy tại

37oC, trong 24 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm tách riêng dịch enzyme ngoại bào và

phần sinh khối thu sinh khối tế bào. Bổ sung 1ml dịch enzyme vào 5ml dung dịch sữa

(Skim milk 100g/l, CaCl2 1,5g/l) đã ủ ở 55 oC trong 5 phút, sau đó ủ tiếp 40 oC. Sinh

khối của các chủng được bổ sung vào 10ml sữa trong ống nghiệm, ủ 42 oC. Sử dụng sữa

tươi thanh trùng bổ sung đường saccharose (120g/l).Theo dõi khả năng đông tụ sữa của

từng mẫu. Khả năng đông tụ sữa được được đánh giá dựa vào các chỉ tiêu: Đông tụ

nhanh, cấu trúc sữa mịn không tách nước [20].

2.2.3 Nghiên cứu các đặc tính probiotic của các chủng LAB

 Khả năng sinh axit hữu cơ

Chủng LAB được nhân khởi động 24 giờ trên môi trường MRS dịch thể, 5%

giống khởi động được cấy truyền sang môi trường MRS dịch, ủ 48 giờ. Sau đó hút 5ml

dịch ni ly tâm thu dịch. Chuẩn độ bằng NaOH 1N để xác định thể tích axit được sinh

ra [63].Thí nghiệm lặp lại 3 lần.



23



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



o



T = VNaOH cần dùng ×10



Hàm lượng axit lactic (mg/ml) = oT ×0.009

(oT: độ Therner, 1oT = 9 mg axit lactic )

 Khả năng sinh protease

Các chủng LAB được nuôi trên môi trường dịch thể MRS tại 37 oC trong 48 giờ.

Thu dịch nuôi, ly tâm loại bỏ tế tào. Nhỏ dịch enzyme ngoại bào thu được vào các

giếng đã đục sẵn trên đĩa thạch chứa 0,1% cơ chất casein. Sau khi ủ ở nhiệt độ 37 oC

trong 24 giờ, sau đó ngâm trong dung dịch axit acetic 1%. Hoạt tính protease được xác

định dựa trên sự xuất hiện vòng trong phân giải casein xung quanh lỗ thạch.

 Khả năng sinh β – galactosidase:

Các chủng LAB được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể ở 37 oC. Sau 24

giờ, thu dịch 1,5ml ni cấy đo OD 600, sau đó ly tâm thu cặn tế bào. Tiếp theo, hòa lại

cặn tế bào với 1,5ml nước muối sinh lý, vontex đều. Sử dụng ống định lượng:

-Các mẫu ống chứa 0,5ml dịch đã hòa lại với nước muối sinh lý và đệm Z.

- Ống đối chứng chưa 1ml đệm Z

Bổ sung SDS 0,1% và chloroform vào các ống định lượng trên, lắc nhẹ và ủ ở

30oC trong 2 phút. Tiếp theo bổ sung tiếp 0,2ml ONPG và ủ ở 30 oC. Sau đó, quan sát

các ống định lượng, ghi thời gian các ống đổi sang màu vàng và dừng bằng cách bổ

sung 0,5ml Na2CO3 1M, lắc nhẹ. Sau đó đo OD 420 và OD550 của các ống, dùng ống đối

chứng làm blank [57].

 Khảo sát khát đặc tính tan máu

Mơi trường thạch MRS được hấp khử trùng 121 oC, 20 phút. Sau đó làm nguội

đến 45oCvà bổ sung 5% máu cừu. Ria cấy các chủng lactic trên bề mặt đĩa thạch ủ tại

24



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



37oC trong 48 giờ, quan sát khả năng tạo vùng tan huyết (β). Sử dụng chủng

Staphylococcus aureus VTCC-B-0658 làm đối chứng [65].

 Khả năng chịu muối mật:

Dựa theo phương pháp của Jatindra 8. Các chủng lactic nuôi trên MRS qua

đêm, chuyển sang mơi trường dịch thể MRS có bổ sung muối mật với các nồng độ:

0%; 0,2%; 0,3%; 0,5% và 1%. Đánh giá khả năng sống sót sau 48 giờ ở 37 oC. Ghi lại

nồng độ muối mật cao nhất vẫn cho thấy sự sinh trưởng của vi khuẩn khi ria trên MRS.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

 Khả năng chịu pH thấp

Dựa theo phương pháp nghiên cứu của Erkkila và Petaja 13. Các chủng vi

khuẩn lactic được nuôi qua đêm trên dịch thể MRS. Thu 1ml sinh khối (10 8 CFU/ml),

ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, bổ sung đệm PBS pH 2, pH 3 và pH 7 ủ trong 3

giờ. Ly tâm, pha bằng nước muối sinh lý, Sau đó, định lượng các chủng LAB sống sót

bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS. Khả năng sống sót của vi khuẩn

sau khi để trong điều kiện pH thấp ≥50% được coi là vi khuẩn có khả năng chịu pH

thấp.

Tỉ lệ sống sót =

Trong đó:



N - Log số khuẩn lạc pH thấp

A - Log Số khuẩn lạc pH7



 Thử nghiệm khả năng chịu điều kiện ruột, dạ dày

Thí nghiệm này thực hiện tho phương pháp được Pinto mô tả năm 2006[57].

Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường Skim milK (15%) với mật độ ban đầu khoảng

108CFU/ml, ủ qua đêm. Pha tỉ lệ 1:1 với dung dịch A (6,2g/l NaCl, 2,2g/l KCl, 0,22g/l

CaCl2, 1,2g/l NaHCO3, Lyzozyme bổ sung sa cho nồng độ cuối đạt 100ppm, ủ trong 5

25



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



phút ở 37oC. Sau đó mẫu được pha loãng tiếp tỉ lệ 3:5 với dung dịch điện giải (6,2g/l

NaCl, 2,2g/l KCl, 0,22g/l CaCl2 and 1,2g/l NaHCO3) điều chỉnh pH 2,5 và 0,3%

pepsin, ủ trong 1 giờ. Tiếp tục pha loãng với dịch tá tràng nhân tạo pH 7,2 (6,4g/l

NaHCO3, 0,225g/l KCl, 1.28g/l NaCl, 0,5% muối mật và 0,1% pancreatin, sau 3 giờ

định lượng số vi sinh vật còn sống sót bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch

[57].

 Thử nghiệm tính kị nước bề mặt tế bào

Chủng LAB được phát triển trong môi trường MRS dịch ở 37 oC trong 18 giờ và

ly tâm ở 12000 g trong 5 phút ở 4 oC. Phần cặn thu được đã được rửa hai lần trong đệm

phosphate pH6,5, và hòa lại trong cùng một đệm. Sau đó, 1ml của dịch trên được đo độ

hấp thụ ở 560 nm. 3ml dung dịch LAB được trộn với 0,6ml n-hexadecan (SigmaAldrich) và khuấy trong 120 giây sử dụng vortex. Sau đó, các dịch này được để tĩnh 1

giờ ở nhiệt độ phòng để tách ổn định 2 lớp. Loại bỏ phần dịch hexadecane cẩn thận và

độ hấp thụ được đo ở 560nm với phần nước. Tỷ lệ phần trăm kị nước được thể hiện

như sau: %kị nước = [(A0-A)/A0]×100, nơi A0 và A là các giá trị độ hấp thụ của dung

dịch nước giai đoạn trước và sau khi tiếp xúc với n-hexadecan, tương ứng (Chauviere

và cộng sự, 1992). Các thí nghiệm kị nước được thực hiện trong 3 lần.

 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

Các chủng LAB được cấy từ ống nghiệm sang bình 250ml chứa mơi trường

MRS dịch và ủ ở 37oC, trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy của các chủng được ly tâm riêng ở

10.000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi được thu lại sau khi ly tâm và được chia 2 phần:

phần 1 dùng để thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh từ dịch nuôi và phần 2

dùng cho thử nghiệm khả năng sản sinh bacteriocin kháng khuẩn bằng cách chỉnh về

pH 6,5 theo như mô tả của Leite và cs., (2015).

Sau khi nuôi 37oC trong 24 giờ quan sát vòng vơ khuẩn xung quanh các giếng.

Kết quả dương tính khi đường kính vòng ức chế > 1mm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.



26



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



 Khả năng kháng chất kháng sinh:

Nghiên cứu thực hiện trên 5 loại kháng sinh ampicillin (10µg), amoxicillin

(10µg), cefalexin (30µg), chloramphenicol ((30µg), tetracycline (30µg) 31. Sử dụng

phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để đánh giá khả năng kháng chất kháng sinh

(National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS, 1993). Không xuất

hiện vòng kháng được ghi nhận là vi khuẩn có khả năng kháng lại chất kháng sinh đó.

2.2.4 Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng

Các chủng vi khuẩn được nuôi trên dịch thể MRS . Sau 24 giờ nuôi tại 37 oC. Tại

các thời điểm nuôi cấy 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ và 30 giờ, mật độ vi khuẩn được

xác định dựa trên phương pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch (CFU).



2.3 Phân loại

2.3.1 Phân loại bằng hình thái

- Quan sát hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn: Vi khuẩn được cấy ria trên

môi trường thạch MRS ở 37oC, sau 48 giờ lấy ra quan sát hình thái bề mặt, màu sắc,

kích thước.

Phương pháp chụp ảnh khuẩn lạc

Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy lên môi trường thạch MRS và được nuôi ở

37oC trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn được cấy ria 3 pha lên môi trường thạch MRS và

được nuôi ở nhiệt độ 37oC. Sau 48 và 72 giờ, từng khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa

thạch được quan sát, mô tả và chụp ảnh dưới kính lúp kết nối máy tính (Stemi 2000,

Carl Zeiss).

Phương pháp nhuộm soi và chụp ảnh tế bào

Từ tế bào được nuôi cấy ở 37 oC trong 48 giờ, vi khuẩn được cố định trên lam

kính và được nhuộm với dung dịch tím kết tinh (2 g tím kết tinh, 20 ml cồn 95 o, 0,8 g

ammonium oxalate và 100 ml nước cất) trong 1 phút. Sau đó, mẫu được cố định với

27



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



dung dịch iốt (2 g KI, 1 g I2 và 100 ml nước cất). Sau khi tẩy bằng cồn 95 o, tế bào

được nhuộm với dung dịch safranin (0,4 g safranin O, 20 ml cồn 95 o và 80 ml nước

cất). Sau khi rửa trơi dung dịch safranin, hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát và

chụp ảnh dưới vật kính soi dầu có độ phóng đại 1.000 lần trên kính hiển vi (Axio A1

imager, Carl Zeiss).

2.3.2 Phân loại bằng sinh học phân tử

Tách chiết ADN

ADN của các chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được tách chiết theo

phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) [28] với một số bước cải biến để phù hợp

với điều kiện phòng thí nghiệm



- Ly tâm 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE.

- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 37oC trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 phút.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),

trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft

khác.

- Thêm 8 l RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút

- Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56oC

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),

trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft

khác.

- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm

15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.



28



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30

phút.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.

- Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô DNA bằng máy cô quay chân khơng.

- Hồ tan DNA trong 50-100l nước hoặc TE.

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g)

để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong

300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn

đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng

độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5

l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

Phân loại dựa trên trình tự gen ARNr 16S

Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen ARNr 16S với cặp mồi

(27F: (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') và 1525R (5'AAAGGAGGTGATCCA GCC-3') [84].

Chu trình nhiệt:

95oC - 3 phút

95oC - 30giây

56oC - 15 giây



30 chu ky



72oC - 1 phút

72oC - 5 phút

4oC - 

Tinh sạch sản phẩm PCR

 Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.



29



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



-



Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.



-



Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút .



-



Đổ bỏ dịch phía dưới cột.



-



Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút



-



Đổ bỏ dịch dưới cột



-



Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút



-



Chuyển cột sang ống Eppendoft mới



-



Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút



-



Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút



-



Lấy dịch phía dưới.



 Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ

tinh sạch : OD260/OD280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

-Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Buffer 5X



9l



Bigdye Ready Reaction premix

H2O



18l

9l



-Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:

Termix



8l



Mồi (*)



1l

1l ( nồng độ ADN là 40-60 g/ml)



ADN khuôn

H2O



10l



(*) Các loại mồi sử dụng:

27F:



5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.



1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.

780F:



5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.'

30



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



350R:



5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.



1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'.

920R:



5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.



-Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen cho đọc trình tự:

96oC - 1phút

96oC - 10giây

50oC - 5 giây



25 chu ky



60oC - 4 phút

3.2.1.5. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

-



Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch



-



Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15

phút ở nhiệt độ phòng.



-



Ly tâm 15.000v/p, 15phút



-



Bỏ dịch, thêm 60l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 phút



-



Làm khô.



-



Thêm 10l HiDi Formamide



-



Để ở 96oC trong 2 phút



-



Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh



-



Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.



-



Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant



Giải trình tự gen ADNr 16S và xây dựng cây phát sinh chủng loại

- Xác định trình tự ADNr 16S, dựng cây phát sinh chủng loại: DNA của các

chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) với

một số bước cải biến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Khuếch đại và xác

định trình tự ADNr 16S theo quy trình của Sakiyama và cộng sự (2009). Trình tự

ADNr 16S được phân tích bởi phần mềm CLUSTAL X (Thompson và cộng sự, 1997).

Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ



31



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



liệu của GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương

pháp của Saitou và Nei (1987); phân tích bootstrap được thực hiện từ 1000 lần lặp lại

ngẫu nhiên, chỉ có những giá trị trên 50% được thể hiện. Weissella viridescens NRIC

1536 và Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO604 được sử dụng làm nhóm ngồi.



2.4 Lựa chọn tổ hợp cho lên men

Tiến hành lên men đơn chủng lên men tổ hợp nhằm chọn ra các tổ hợp có sản

phẩm chất lượng đạt yêu cầu cảm quan theo TCVN 7030:2002

 Phương pháp đo pH:

Giá trị pH được đo trên máy Horiba F-51 (Nhật Bản) tại các thời điểm lên men

sữa chua và các thời điểm bảo quản sữa.

 Phương pháp lên men

Chủng LAB được thử nghiệm lên men theo các bước dưới đây:





Chuẩn bị men giống: Hoạt hoá lần 1 từ ống nghiệm sạch chuyển



sang đĩa thạch MRS, ủ trong 37oC qua đêm  Hoạt hoá lần 2- Chuyển giống

vào ống nghiệm dịch thể MRS, ủ 37oC trong 18 giờ  Đo OD, thu sinh khối, ly

tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút.



Chuẩn bị nguồn sữa lên men: Sữa TH thanh trùng không đường,

bổ sung đường saccharose (120g/l), ủ tại 42oC trong 1 giờ.



Cấy giống vào các cốc sữa ấm, duy trì nhiệt độ lên men là 42 oC.

Kiểm tra pH trong quá trình lên men



Kết thúc lên men khi pH đạt 4,3 – 4,5. Sản phẩm được bảo quản

lạnh 4oC.

Đánh giá theo chỉ tiêu về thời gian lên men và các chỉ tiêu cảm quan: trạng thái,

màu sắc, hương vị và chất lượng sản phẩm .

 Phương pháp đánh giá chất lượng sữa chua:

32



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



Đánh giá chất lượng sữa chua được thử nghiệm dựa vào màu sắc, hương vị, cấu

trúc và mức độ đông của sữa chua thành phẩm. Mỗi lần đánh giá hương và vị của sữa

chua, phiếu đánh giá được phát đi cho 10 cán bộ kiểm nghiệm và kết quả về hương, vị

và cấu trúc được đánh giá và sắp xếp theo thứ tự 1,2,3... về chất lượng. Kết quả ghi

nhận theo tần xuất đánh giá cao nhất của sản phẩm đó.

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu cảm quan sữa chua

Tên chỉ tiêu



Yêu cầu



Màu sắc

Mùi, vị

Trạng thái



Màu trắng sữa hoặc màu đặc trưng của phụ liệu bổ sung

Đặc trưng cho từng loại sản phẩm

Mịn, đặc sệt



2.4.2 Lên men đa chủng

Các chủng lựa chọn được tạo thành các tổ hợp từ 2-4 chủng. Các chủng LAB

ni tĩnh trong bình tam giác 100ml chứa môi trường MRS dịch thể, tại 37 oC, 24 giờ.

Sau đó, đo OD600 dịch ni cấy và dựa vào kết quả này để tính tốn lượng sinh khối

cần thu. Ly tâm thu lượng sinh khối thích hợp để tiến hành lên men 200 ml sữa, ủ ở

42oC. Theo dõi pH trong quá trình lên men. Bảo quản sữa chua tại 4 oC và đánh giá

cảm quan sản phẩm sau 3 ngày. Mỗi lần đánh giá hương và vị của sữa chua, phiếu đánh

giá được phát đi cho 5 cán bộ kiểm nghiệm và kết quả về hương, vị và cấu trúc được

đánh giá dựa trên tần xuất cao nhất mà các phiếu nhận xét đưa ra.

Sau khi kết thúc quá trình lên men, các mẫu sữa chua được bao kín và bảo quan

trong điều kiện ngăn mát tủ lạnh (4oC). Độ giảm pH được đánh giá và cảm quan tại các

thời điểm 1, 2 và 3 tuần. Đánh giá dựa trên các đặc tính sản phẩm của sữa chua Ba Vì

như sữa đơng sánh, mịn và dẻo, hương lên men sữa chua rõ ràng và vị chua ngọt đậm

đà.



33



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

2 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×