Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



3.1.1.2 Khả năng làm đông sữa

Các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá khả năng làm đông sữa qua hai thí

nghiệm là khả năng làm đơng sữa của enzyme ngoại bào và khả năng làm đơng sữa

trong q trình sinh trưởng. Kết quả cho thấy:

Dịch enzyme ngoại bào nuôi cấy sau 48 giờ của các chủng vi khuẩn lactic khi

được bổ sung vào dung dịch sữa (Skim milk 100g/l, CaCl2 1,5g/l) ủ tại 40 oC đều cho

kết quả làm đông sữa sau 15 giờ. Kết quả này chứng minh rằng tám chủng vi khuẩn

lactic trên đều sinh ra enzyme ngoại bào có tác động làm đơng sữa.

Thí nghiệm thứ hai là đánh giá khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn

lactic trong quá trình sinh trưởng. Kết quả làm đông sữa khi cấy sinh khối các chủng vi

khẩn lactic trực tiếp vào trong 10ml sữa ủ tại 42oC, sau 10 giờ thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.1. Khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic

STT



Kí hiệu

chủng



OD600



KN

đơng tụ



STT



Kí hiệu chủng



OD600



KN

đơng tụ



1



M01



2,18



++



5



3492



2,09



++++



2



2991



2,53



+++



6



BH



2,07



++



3



4045



1,49



++



7



Ca



2,98



+++



4



LA



1,54



++



8



8905



1,76



++



(Chú thích: + Đơng chậm ; ++ Đông chậm, tách nước; +++ Đông nhanh, tách nước;

++++ Đông nhanh, mịn)

Từ bảng kết quả trên cho thấy 8 chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm đơng sữa

khác nhau. Trong đó, ba chủng có khả năng làm đông sữa tốt nhất là chủng 3492 thuộc

chi Streptococcus, hai chủng 2991 và Ca thuộc chi Lactobacillus.



39



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



3.1.2 Các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic

Tám chủng lactic được nghiên cứu tiếp một số đặc tính probiotic như khả năng

sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease, khả năng kháng vi

sinh vật gây bệnh…

3.1.2.1 Khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme β- Galactosidase, protease

Kết quả nghiên cứu khả năng sinh axit hữu cơ, khả năng sinh enzyme βGalactosidase, protease được trình bày trong bảng 3.2 chọn các tổ hợp bao gồm những

chủng có nhiều đặc tính probiotic. Các kết quả về đặc tính probiotic các chủng nghiên

cứu được trình bày dưới đây:

Bảng 3.2. Một số đặc tính probiotic của các chủng lactic

Kí hiệu

chủng



Khả năng sinh axit

hữu cơ (g/l)



Hoạt độ β-galactosidase

(nmol/phút)



M01

2991

4045

LA

3492

BH

Ca

8905



0,88

0,92

0,33

0,46

0,85

0,84

0,68

0,21



29,61

76,65

129,10

218,58

23,24

23,24

46,37

9,45



Protease (D,

mm)

21

10

0

13

10

27

12

17



Trong bảng trên, 4 chủng có khả năng sinh axit hữa cơ cao nhất là các chủng

M01, 2991, 3492 và chủng BH. Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường

dịch thể MRS và được đánh giá khả năng sinh enzyme β-galactosidase theo phương

pháp định lượng của Miller, 1972. Hoạt tính β –galactosidase của tám chủng nghiên

cứu được thể hiện trong bảng 3.2 . Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn lactic đều có

khả năng sinh enzyme β –galactosidase trong đó các có hoạt tính β -galactosidase cao

là chủng 2991 có hoạt tính β -galactosidase 76,65nmol/phút; 4045 đạt 129,1nmol/phút

và LA đạt 218nmol/phút. Các chủng M01 và chủng BH thể hiện khả năng phân giải

cazein cao. Đây là các đặc tính có liên quan chặt chẽ đến khả năng làm đơng sữa của

40



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



các chủng vi khuẩn lactic. Từ các kết quả này thấy rằng 7/8 chủng có tiềm năng hơn

trong khả năng lên men sữa, phân giải lactose trong sữa tạo đường dễ hấp thu. Chủng

8905 cho thấy khả năng sinh axit hữu cơ và enzyme β- Galactosidase, protease thấp.



.

Hình 3.2. Vòng phân giải cazein của chùng BH và chủng M01

3.1.2.2 Khả năng làm tan máu, khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp, chịu điều iện

ruột, dạ dày và tính kị nước trên bề mặt tế bào





Khả năng chịu muối mật

Các chủng lactic được nuôi trên môi trường dịch thể MRS có bổ sung muối mật



với các nồng độ 0,2%, 0,3%, 0,5% và 1% ở 37 oC trong 24 giờ. Đối chứng là môi

trường MRS không bổ sung muối mật. Theo Gilliland và cộng sự, nồng độ 0,3% là

nồng độ quan trọng để sàng lọc các chủng đề kháng dựa theo nồng độ của dãy mật

người từ 0,1 đến 0,3% [20,21]. Cụ thể: hai chủng M01 và 4045 không có dấu hiệu sống

sót trên tất cả các mẫu có bổ sung muối mật, hai chủng BH và 2991 cho thấy khả năng

sống sót và sinh trưởng trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,2%. Các chủng còn lại

đều có thể tồn tại trong mơi trường có nồng độ muối mật > 0,3%. Trong đó 8905 tồn tại

được trên mơi trường có nồng độ muối mật 0,5%, nồng độ muối mật 1% có các chủng

LA, 3492 và Ca có thể sống sót và sinh trưởng.







Đặc tính tan máu



41



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



Các chủng được cấy ria trên mơi trường MRS có bổ sung 5% máu cừu, ủ tại

37oC trong 24± 2 giờ. Kết quả cho thấy khơng có chủng nào dung huyết kiểu β (không

làm tan máu).





Chịu pH thấp, chịu muối mật, tính kị nước và chịu điều kiện ruột, dạ dày

Sau 3 giờ ủ trong đệm PBS pH 2, không thấy dấu hiệu sống sót của 8 chủng vi



khuẩn lactic nghiên cứu. 8 chủng vi khuẩn lactic khi ủ với PBS pH 3 trong 3 giờ cho

thấy 4/8 chủng có tỉ lệ sống sót >50% là M01, 2991, 4045 và Ca.

Bảng 3.3. Khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp và tính kị nước của các chủng lactic



81,11



Chịu điều kiện

dạ dày, ruột

(Log CFU/ml)

2,05



Tính kị

nước

(%)

42,5



0,2



74,91



5,31



39,2



4045



<0,2



50,58



0



29,6



LA



1



49,66



7,12



31,5



3492



1



0,56



1,22



13,1



BH



0,2



0



0



18,3



Ca



1



86,51



8,90



37,7



8905



0,50%



49,21



5,64



31,4



Kí hiệu chủng



Khả năng chịu

muối mật (%)



Khả năng chịu

pH thấp (%)



M01



<0,2



2991



Từ kết quả bảng trên cho thấy các chủng thuộc nhóm Streptococcus khơng có

khả năng chịu pH thấp. Các chủng Ca, M01 và 2991 có khả năng chịu axit cao, sau 3

giờ khả năng sống sót >80%. Với nồng độ muối mật ≥0,5% có 4 chủng có khả năng

sống sót đó là các chủng Ca, M01, 2991 và chủng 4045. Và sau khi đi qua hệ dạ dày,

ruột, dưới sự tác động của axit dạ dày, muối mật và các enzyme thủy phân, các chủng

M01, 2991, LA, 3492, Ca và LA tồn tại được. Trong nghiên cứu của [57]. Đây là đặc



42



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



điểm có lợi của các chủng vi khuẩn lactic, khi được bổ sung và tồn tại trong hệ tiêu

hóa. Giúp tăng cường khả năng miễn dịch cũng như cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

trong cơ thể đặc biệt là đối với hệ tiêu hóa của trẻ nhỏ.

Khả năng tự kết dính giúp cho vi khuẩn lactic kết dính lại với nhau để hình

thành một quần thể lớn, giúp tăng cường được sức sống và sự phát triển của chủng theo

kiểu mối quan hệ hỗ trợ cùng lồi. Khả năng tự kết dính còn có sự liên quan đến khả

năng bám dính đường ruột và còn làm tăng khả năng lưu lại trong đường tiêu hóa của

chủng vi sinh vật.

Các chủng khác nhau có tính kị nước bề mặt tế bào là khác nhau. Khả năng bám

dính vào ethyl acetate (dung mơi có tính base) phản ánh tính phân cực và tính acid của

bề mặt tế bào vi khuẩn lactic. Khả năng bám dính ethyl acetate cao có khả năng kéo

theo cơ hội bám dính vào những yếu tố phân cực có tính bazơ trong biểu mơ ruột. Theo

Maria (2006), khả năng bám dính ethyl acetate của một số chủng L. johnsonii, L.

plantarum, L. paracasei, L. casei nằm trong khoảng 0 ÷ 79,2%. Khả năng bám dính

với dung mơi ethyacetate của Lb. casei cho kết quả nằm trong khoảng 10 ÷ 60%

(Provencio et al., 2009). Tính ưa nước của bề mặt tế bào vi khuẩn có thể là do các hợp

chất có tính acid hoặc base trên bề mặt, hoặc có thể có cả hai. Sự bám dính của tế bào

vi khuẩn với chloroform (dung mơi có tính acid) phản ánh tính base của bề mặt tế bào.

Provencio và đồng tác giả (2009) công bố khả năng bám dính với dung mơi chloroform

của. Lactobacillus casei từ 20 đến 98%. Maria (2006) đã ghi nhận khả năng bám dính

chloroform của một số chủng trong các lồi L. johnsonii, L. plantarum, L. paracasei,

L. casei thay đổi từ 11,6% đến 100%. Trong kết quả nghiên cứu của 8 chủng lactic

này, tính kị nước của bề mặt tế bào khá đa dạng từ 13,1% đến 42,5%.



3.1.2.3 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

Khả năng sinh bacteriocin là một đặc tính quan trọng của các chủng khi nghiên

cứu các vi khuẩn có lợi. Sáu chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm 4 vi khuẩn gram

43



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



dương (B. cereus, Micrococcus luteus, Listeria innocua, Staphylococcus aureus) và 2

vi khuẩn gram âm (E. coli, Salmonella enterica). Kết quả đường kính vòng kháng

khuẩn được ghi lại trong bảng 3.4

Bảng 3.4. Kích thước vòng kháng khuẩn của các chủng lactic



KH

chủng

M01

2991

4045

LA



B. cereus

Dịch PH

ni 6,5

14

12

15

13

0

0

13

11



Đường kính vòng kháng khuẩn (D ±1, mm)

E. coli

Mic

Lis

Sal

Dịch PH Dịch PH Dịch PH Dịch PH

nuôi 6,5 nuôi 6,5 nuôi 6,5 ni 6,5

13*

10*

31

24

14

13

14

0

16

12

35

29

17

13

14

13

0

0

17

14

13

9

0

0

0

0

25

19

15

11

0

0



Sta

Dịch PH

ni 6,5

17

13

15

15

12

12

16

10



3492



7



6



12*



10*



24



21



10



6



0



0



10



0



BH

Ca

8905



13

15

11



11

14

8



13

12*

0



11

10*

0



30

36

28



30

25

21



13

16

11



12

14

0



0

13

7



0

10

0



12

17

12



14

15

0



(*) vòng kháng khuẩn mờ

Mic - Micrococcus luteus, Lis - Listeria innocua, Sal - Salmonella enterica,

Sta - Staphylococcus aureus

Bảng trên cho thấy tất cả các chủng lactic trong nghiên cứu có phổ kháng khuẩn

rộng. Chúng kháng được cả vi khuẩn gram (+) và gram (-). Trong đó 4 chủng có khả

năng kháng khuẩn tốt nhất là M01, 2991, Ca (kháng 6/6 chủng kiểm định) và Ca

(kháng 5/6 chủng kiểm định). Nhờ đó, sự tồn tại của các chủng vi khuẩn lactic này

trong sữa lên men làm cho sữa trở thành thực phẩm dinh dưỡng an tồn, có lợi cho sức

khỏe. Đặt biệt, khi chúng có thể tổn tại trong hệ đường ruột của người sẽ ức chế các vi

khuẩn gây bệnh đường ruột như E.coli, S. aureus, S. enterica… Hiện nay, các chủng vi

khuẩn kháng chất kháng sinh ngày càng nhiều, vì vậy thay thế sử dụng thuốc kháng

sinh bằng các sản phẩm probiotic là một biện pháp hiệu quả hơn. Trong kết quả nghiên

cứu trên, kích thước vòng kháng vi khuẩn kiểm định của dịch ni khi được chỉnh pH

có giảm 1-5mm so với dịch ni ban đầu. Điều này cho thấy trong quá trình sinh



44



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



trưởng của các vi khuẩn lactic, việc sinh axit làm giảm pH của môi trường cũng ức chế

sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, khả năng sinh bacteriocin của các

chủng trong nghiên cứu cũng thể hiện rất rõ ràng.



Hình 3.3.Vòng kháng M. luteus của các chủng vi khuẩn lactic đại diện



Hình 3.4 Vòng kháng L. innocua của chủng 2991

(A)Vòng kháng dịch ni ban đầu

(B) Vòng kháng dịch nuôi đã chỉnh pH

Ngày nay, bacteriocin đã được sử dụng rộng rãi, đặc biệt trong lĩnh vực bảo quản

thực phẩm như sữa, trứng, rau và thịt. Và bacteriocin từ các chủng vi khuẩn lactic đã

được chứng minh là hiệu quả cao trong việc chống lại các bệnh gây ngộ độc thực phẩm

và hư hỏng thực phẩm. Có thể ứng dụng bacteriocin bằng cách sử dụng thực phẩm lên

45



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



men bởi các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin. Chủng giống khởi

động trong lên men sữa có đặc tính sinh bacteriocin giúp tạo ra thực phẩm dinh dưỡng

an toàn, có lợi cho sức khỏe. Ngồi ra, lợi ích của việc sử dụng giống khởi động có

hoạt tính bacteriocin cao cũng hỗ trợ qua trình bảo quản các sản phẩm thực phẩm được

hiệu quả, tiết kiệm chi phí hơn. Trong số các vi khuẩn lactic sản xuất bacteriocin, câc

chủng thuộc chi Lactobacillus được đặt biệt chú ý [78].

Trong tám chủng nghiên cứu, ba chủng thuộc chi Lactobacillus cho thấy khả

năng sinh bacteriocin cao là M01, 2991 và Ca (vòng kháng ≥20mm đối với

Micrococcus luteus). Theo tổng hợp của Ahmed (2010), bacteriocin do các chủng L.

acidophilus là acidophilucin, acidocin và lactacin [8]. L. casei là vi khuẩn an tồn, tìm

thấy nhiều trong ruột người và động vật. L. casei sinh caseicin, lactocin [78]. L.

bulgarricus cũng là lồi có hoạt tính bacteriocin cao (Tail và công sự 2011). Trong

nghiên cứu này, chủng BH thuộc chi Sreptococcus cũng cho kết quả kháng vi sinh vật

kiểm định cao. Ngồi ra còn có rất nhiều loài vi khuẩn lactic khác cũng sinh

bacteriocin như L. johnsonii sinh Lactacin F, L. lactis sinh Lactoccin G , Lactococcus

lactis sinh Nisin [78]. Đã có rất nhiều báo cáo nghiên cứu đều cho thấy khả năng kháng

vi sinh vật gây bệnh cao của các vi khuẩn lactic. Vitali và cộng sự (2012) phân lập

được các loài LAB khác nhau (90 phân lập) từ oliu sản xuất các chất chống khuẩn

chống vi khuẩn gây bệnh gram âm và gram dương như S. aureus. E. facalis,

Salmonella enterica. Nghiên cứu khác của Messaoudi (2012) cho thấy bacteriocin của

các chủng lactic phân lập từ gà ức chế chống lại một số mầm bệnh gây ra bởi thực

phẩm như L.monocytogenes, S.aureus và Salmonella mà không ức chế LAB [77].

3.1.2.5 Khả năng kháng chất kháng sinh

Các vi khuẩn lactic được nuôi qua đêm trên môi trường dịch thể MRS. Khả

năng kháng chất kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp đặt khoanh giấy kháng

sinh. Vi khuẩn được ghi nhận là kháng kháng sinh nếu không xuất hiện vòng kháng.



46



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



Thí nghiệm được thực hiện với 5 loại kháng sinh ampicillin (amp-10µg/l),

amoxicillin (amo-10µg/l), cefalexin (cef -30µg), chloramphenicol (chl-30µg/l),

tetracycline (tet-30µg) 65. Đối chứng là khoanh giấy khơng tẩm kháng sinh. Kết quả

được thể hiện trong bảng 3.5

Bảng 3.5. Khả năng kháng chất kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic



Nhóm

L. bulgaricus

L. acidophilus



S. thermophilus

L. casei

L. sakei



KH

chủng

M01

2991

4045

LA

3492

BH

Ca

8905



Đường kính vòng kháng (mm)

Ap10



Am10



C30



Ch30



T30



26

23

29

25

28

33

26

30



26

22

30

28

30

37

23

28



0

0

0

0

0

0

0

0



0

0

0

0

0

0

0

0



20

20

27

28

22

26

19

25



Đối

chứng

0

0

0

0

0

0

0

0



Ghi chú: Ap10 : Ampicillin (10µg/l); Am10 : Amoxicilline (10µg/l); T30:Tetracycline

(30µg/l); Ch30 : Chloramphenicol (30µg/l), C30: cefalexin (30µg/l).

Hiện nay tính kháng kháng sinh của vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu nhiều

do vấn đề thực phẩm từ động vật có chứa chất kháng sinh, từ đó có thể gây xuất hiện

ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại kháng sinh. Điều đáng lo

ngại của các nhà khoa học là những vi sinh vật này có thể chuyển gen kháng kháng

sinh cho các vi khuẩn có hại. Nghiên cứu tính an tồn của các chủng probiotic, người ta

cũng lưu ý đến việc chủng đó có mang gen kháng kháng sinh hay không. Các nghiên

cứu từ rất lâu trước đây đã cho thấy khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi

khuẩn lactic như nghiên cứu của Marth và cộng sự (1959), Renbold và cộng sự (1974)

và nghiên cứu của Sozzi (1980) còn cho thấy sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh

của các chủng S. thermophilus và L. bulgaricus so với các nghiên cứu trước đó [69].



47



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



Kết quả nghên cứu này cho thấy cả 8 chủng thể hiện tính kháng cefalexin và

chloramphenicol và nhạy cảm với ampicillin, amoxicillin, tetracycline. Các nghiên

cứu của Danielsen và Wind (2003), Coppola và cộng sự (2005) chỉ ra rằng thành tế bào

của các loài Lactobacillus dễ bị tổn thương bởi các chất ức chế tổng hợp như penicillin

và ampicillin. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Gamal và cộng

sự (2014) là các chủng lactic nhạy cảm cao với ampicillin và amoxicillin. Đối với

kháng sinh ức chế tổng hợp protein như chloramphenicol, các lồi Lactobacillus có khả

năng kháng lại chúng theo nghiên cứu của các tác giả Coppola và cộng sự (2005),

Klare và cộng sự (2007). Trong nghiên cứu này, cả 8 chủng nghiên cứu đều cho thấy

khả năng kháng lại chloramphenicol 30µg/l. Korhonen và cộng sự (2008), Hoque và

cộng sự (2010) cho rằng các loài Lactobacillus có sự đề kháng khác nhau đối với

tetracyclin, kết quả nghiên cứu 8 chủng này cũng đồng ý với ý kiến trên. Có lẽ, sự biến

đổi rộng rãi của cơ chế kháng tetracyclin mang lại mức độ nhạy cảm đa dạng của các

chủng lactic với tetracyclin(Roberts 2005).

Các gen kháng kháng sinh của LAB đã được mô tả và xem xét trong nghiên cứu

củaAmmor và cộng sự (2007). Hai trong số những gen kháng kháng sinh phổ biến nhất

được tìm thấy trong LAB là tet (M) đối với tính kháng tetracyclin và erm (B) đối với

erythromycin, tiết theo là các gen cat mã hóa kháng chloramphenicol (Lin và cộng sự,

1996, Danielsen ,2002, Gevers và cộng sự, 2003, Cataloluk and Gogebaka,2004).

Nawaz et al. (2011) báo cáo rằng trong số 84 chủng LAB, gen erm (B) được phát hiện

ở 08 chủng thuộc Lactobacillus và 01chủng Streptococcus thermophilus. Các gen tet đã

được xác định trong 12 chủng lactobacilli từ thực phẩm truyền thống. Trong nghiên

cứu của một số tác giả thì khả năng kháng kháng sinh của các lồi vi khuẩn lactic được

giải thích nhờ cấu trúc thành tế bào hoặc màng tế bào chống thấm hoặc theo một vài cơ

chế khác. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn probiotic lactic này kết hợp với việc điều trị

bệnh cần sử dụng kháng sinh sẽ khắc phục được những tác động không mong muốn do

kháng sinh mang lại.



48



Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)



3.1.2.4 Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB

Theo dõi mật độ LAB ở các thời điểm 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ và 30 giờ

định lượng mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Mật độ

cấy ban đầu là 1,9 - 2,1.105 CFU/ml.



Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB

Kết quả cho thấy 6/8 chủng có khả năng sinh trưởng tốt đạt trên 108 CFU/ml, hai

chủng LA và 4045 có khả năng sinh trưởng kém hơn trên MRS. Chủng 3492 có khả

năng tạo sinh khói tốt nhất đạt 7,8.10 11 sau 24 giờ nuôi cấy. Lựa chọn những chủng có

khả năng sinh trưởng tốt có thể tạo điều kiện dễ dàng hơn trong việc nghiên cứu tiếp

theo và tiết kiệm chi phí sản xuất sau này. Vì vậy, khi lựa chọn chủng lactic cho ứng

dụng làm giống khởi động, ngoài các đặc điểm probiotic khác, chủng nào có khả năng

sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên hơn các chủng có khả năng sinh trưởng yếu hơn.



49



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×