Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

nhanh và thể tích của tất cả các mẫu bị giảm đáng kể sau q trình đùn. Bên cạnh đó, PL

cũng có thể bị giữ lại ở màng polycarbonat, do vậy dù có điều chỉnh thể tích, nồng độ

lipid cũng sẽ khơng chính xác như ban đầu. Do vậy, việc sử dụng các hệ này để bào chế

gel và đánh giá lưu biến là khơng phù hợp vì sẽ gây sai số do tổng nồng độ lipid là một

yếu tố quan trọng nhất quyết định tới đặc tính lưu biến của hệ.

 Siêu âm với thiết bị đầu dò Ultrasonic Homogenizer (QSONICA – Mỹ): Các khảo

sát với máy siêu âm đầu dò được tiến hành với các mẫu liposome có thành phần tương tự

như các phương pháp trên với các thời gian siêu âm khác nhau ở cường độ (amplitude)

tối thiểu của thiết bị là 20%. Kết quả cho thấy, khi sử dụng máy siêu âm đầu dò với thời

gian siêu âm liên tục khoảng 7 phút, KTTP thu được khoảng 150 nm nhưng mẫu bị đa

phân tán PDI > 0,3. Ở thời gian siêu âm 3 phút, liposome đo được dao động trong khoảng

từ 5 – 10 µm và có giá trị span > 3, đồ thị phân bố kích thước có nhiều pic, cho thấy mẫu

bị đa phân tán. Các thí nghiệm sử dụng chế độ siêu âm ngắt qng và khuấy trộn trong

q trình siêu âm khơng giúp cải thiện tình trạng đa phân tán của các mẫu liposome bào

chế được. Bên cạnh đó, các mẫu sau siêu âm chứa tạp đen, có thể là do titan nhiễm từ đầu

dò. Do vậy, các hệ liposome bào chế bằng siêu âm đầu dò cũng khơng phù hợp.

 Siêu âm bể: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp siêu âm bể có nhiều ưu điểm

và phù hợp để thu được các hệ liposome phục vụ cho các mục tiêu của đề tài. Cách tiến

hành cụ thể như sau: Các lọ chứa hỗn dịch liposome thô thu được như mô tả ở mục 2.3.2

được siêu âm bể với các khoảng thời gian khác nhau, nhiệt độ nước trong bể duy trì trong

khoảng 65-70℃, mực nước trong bể siêu âm cao hơn mực nước trong các lọ khoảng 3 –

5 mm. Tỷ lệ các thành phần và KTTP của các hệ thu được được trình bày cụ thể trong

bảng 3.1.



20



Bảng 3.1 KTTP thu được sau siêu âm bể của các cơng thức, mơi trường hydrat hóa khác

nhau: mannitol 5%, HEPES 10mM (HEPES/Man); glucose 5%, HEPES 10mM

((HEPES/Glu) và đệm phosphat salin (PBS).



Tên

mẫu



Tổng

nồng

độ

lipid

(mM)



Tỷ lệ

mol

DSPE

– PEG

2000

(%)



1



50



2



Mơi trường

hydrat hố



Thời

gian

siêu âm

cần thiết

(phút)



D4.3

(µm)



D50

(µm)



D90

(µm)



Span



0



HEPES/Man



70



7,77



6,86



13,4



1,425



50



1



HEPES/Man



35



15,8



13,9



28,5



1,613



3



50



5



HEPES/Man



35



15,0



12,9



25,3



1,650



4



50



5



HEPES/Glu



35



15,0



13,0



27,5



1,689



5



50



5



PBS



35



26,3



19,4



54,0



2,374



6



50



5



HEPES/Man



50



7,23



5,89



10,9



1,392



7



50



5



HEPES/ Glu



50



7,67



6,68



10,7



1,415



8



50



5



PBS



50



15,2



13,4



27,0



1,553



9



100



5



HEPES/Man



90



7,67



6,47



14,1



1,684



10



50



1



HEPES/Man



70



KTTP : 137 nm, PDI : 0,241



11



50



5



HEPES/Man



70



KTTP : 134 nm, PDI : 0,234



Nhận xét:

Siêu âm bể có nhiều ưu điểm hơn hẳn các biện pháp giảm KTTP khác đã khảo sát:

 Khối lượng và thể tích mẫu hầu như khơng thay đổi trong q trình siêu âm, tổng

nồng độ lipid khơng thay đổi so với ban đầu do tránh được việc phải chuyển mẫu

qua nhiều loại dụng cụ khác nhau.

 KTTP phụ thuộc vào thời gian siêu âm nhưng không bị thay đổi quá nhanh trong

thời gian ngắn, giúp thu được các vùng kích thước khác nhau.

21



 Có thể thu được KTTP ở các vùng kích thước khác nhau và các nồng độ khác

nhau, KTTP của liposome thu được bằng siêu âm bể ít bị đa phân tán hơn so với

siêu âm đầu dò. Mặc dù giá trị PDI của các hệ nano còn tương đối lớn nhưng vẫn

< 0,25, vẫn phù hợp để sử dụng trong các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của

KTTP lên đặc tính lưu biến của HA.

 Lượng nguyên liệu cần sử dụng cho mỗi công thức nhỏ, phù hợp với giai đoạn

khảo sát, nghiên cứu tiền công thức. Bên cạnh đó, nồng độ lipid cao trong các mẫu

(có thể lên tới 50 - 100mM) có thể sẽ giúp làm giảm hư hao dược chất trong các

thí nghiệm sau này, đặc biệt là khi dược chất được đưa vào pha nước.

 Sự có mặt của DSPE-PEG 2000 có ảnh hưởng đáng kể tới KTTP. Cụ thể, để giảm

KTTP tới khoảng 7 µm, mẫu khơng chứa DSPE-PEG 2000 cần 70 phút trong khi

mẫu chứa DSPE-PEG 2000 chỉ cần khoảng 50 phút. Tuy vậy, khơng có sự khác

biệt đáng kể về KTTP giữa các mẫu chứa 1 và 5% DSPE-PEG 2000.

Do các ưu điểm nêu trên, phương pháp siêu âm bể được sử dụng để bào chế các mẫu

liposome để tiến hành các khảo sát tiếp theo của đề tài.

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn mơi trường hydrat hóa

3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường hydrat hóa tới KTTP liposome

Mơi trường hydrat hố cũng có ảnh hưởng đáng kể tới sự hình thành, KTTP cũng

như độ ổn định về KTTP của hệ. Cụ thể, mẫu hydrat hóa bằng HEPES/Mannitol và

HEPES/Glucose có màng phim bong nhanh và phân tán đều vào mơi trường sau 12 giờ

hydrat hố mà khơng cần tác động lực gây phân tán trong khi mẫu trong PBS bị kết tụ và

lắng đọng dưới đáy lọ (hình 3.5). Kết quả làm giảm KTTP cho thấy mẫu hydrat hóa bằng

PBS cần thời gian siêu âm dài hơn so với 2 mẫu hydrat hóa bằng HEPES/Mannitol và

HEPES/Glucose (bảng 3.1).

Các hệ có KTTP µm được lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng của môi trường tới độ

ổn định của liposome do KTTP lớn hơn, dễ mất ổn định hơn về lý thuyết so với các hệ

nm. Sau 1 tuần bảo quản, mẫu trong PBS bị lắng đọng dưới đáy trong khi các mẫu trong

HEPES/Man và HEPES/Glu vẫn phân tán được đều trong môi trường.

22



b) Theo dõi độ ổn định sau 1 tuần



a) Sau khi q trình hydrat hóa



Hình 3.1 Hình ảnh mẫu màng phim hydrat hoá (từ trái qua phải lần lượt bằng

HEPES/Mannitol, HEPES/Glucose và PBS)

Kết quả này phù hợp với một số kết quả khảo sát nghiên cứu về các liposome cấu

tạo từ các phospholipid có gốc acyl bão hoà như DPPC hay DMPC. Kết quả chung của

các nghiên cứu này cho thấy các liposome này bị kết tụ trong các môi trường giàu chất

điện ly như NaCl 0,9% hay PBS. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do các chất

điện ly này có khả năng tương tác và làm thay đổi bán kính hydrat hố của gốc cholin

lưỡng cực, dẫn tới sự thay đổi về chỉ số sắp xếp tới hạn (critical packing parameter) và

làm tăng tính linh động của phân tử phospholipid. Do vậy, 2 môi trường glucose

5%/HEPES 10mM và mannitol 5%/HEPES 10mM được lựa chọn để tiếp tục theo dõi độ

ổn định về KTTP.

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá KTTP của các mẫu thử độ ổn định

trong các mơi trường khác nhau.

Mơi trường

hydrat hóa



HEPES/Man

HEPES/Glu



Thời

gian

siêu

âm

(phút)

40

40



KTTP ban

đầu

D4.3 Span

(µm)

11,8 1,414

11,9 1,667



KTTP sau 1

tuần



KTTP sau 2

tuần



D4.3

(µm)

13,3

13,8



D4.3

(µm)

17,6

16,9



23



Span

1,868

2,084



Span

2,264

2,305



KTTP sau 2

tuần thêm

HA

D4.3 Span

(µm)

17,5 2,261

17,0 2,301



Nhận xét: KTTP của cả 2 mẫu liposome đều tăng đáng kể sau 2 tuần bảo quản.

Tuy nhiên, khi thêm HA vào hỗn dịch liposome để đạt nồng độ cuối cùng là HA 2,0%,

tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 4℃, sau 2 tuần đánh giá lại thì nhận thấy KTTP của cả 2

mẫu đều khơng thay đổi. Có thể thấy, mơi trường hydrogel HA cũng có tác dụng rất tốt

trong việc chống kết tụ, ổn định tiểu phân liposome. Do vậy, 2 môi trường glucose

5%/HEPES 10mM và mannitol 5%/HEPES 10mM được lựa chọn để tiến hành các

nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Ảnh hưởng của môi trường hydrat hóa liposome tới đặc tính lưu biến của gel

HA

Ảnh hưởng của mơi trường hydrat hố tới đặc tính lưu biến của gel HA được đánh

giá khi có và khơng có tác nhân oxy hoá H2O2. Kết quả khảo sát cho thấy khơng có sự

khác biệt đáng kể về độ nhớt nghỉ của gel HA chứa mannitol 5% và glucose 5% khi

khơng có mặt tác nhân oxy hố (38,0 và 40,3 Pa.s). Tuy vậy, khi H2O2 được thêm tới

nồng độ 5% vào các gel nói trên, có sự khác biệt đáng kể về các đặc tính lưu biến giữa

các mẫu chứa mannitol và glucose. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.



Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn thay đổi độ nhớt phức hợp của các mẫu gel trong 2 môi trường

Glucose/HEPES và mannitol/HEPES với độ nhớt phức hợp

ban đầu theo thời gian khi thêm H2O2

24



Nhận xét: Tất cả các mẫu đều bị pha loãng với cùng một mức độ khi thêm H2O2.

Tuy vậy, có thể thấy rằng ở cả 2 nồng độ HA 1% và 2%, các mẫu trong mannitol 5% đều

có độ nhớt giảm ít hơn so với các mẫu tương ứng chứa glucose 5%. Có thể thấy, mannitol

có khả năng bảo vệ HA khỏi tác nhân oxy hoá, trong khi glucose khơng có tính chất này

hoặc kém hơn so với mannitol. Trong các bệnh về khớp, HA dễ bị oxy hoá bởi các gốc

oxy phản ứng (reactive oxygen species) , giảm khối lượng phân tử [5]. So với các chất

chống oxy hố khác, mannitol có ưu điểm là ít gây ra các phản ứng phụ không mong

muốn, dễ tan. Do vậy, môi trường mannitol 5%/HEPES 10mM được lựa chọn để bào chế

gel HA và gel HA chứa liposome cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Đánh giá đặc tính lưu biến của gel HA và gel HA chứa liposome

Kết quả đánh giá các đặc tính lưu biến cho thấy, các mẫu gel HA cũng như mẫu

gel HA chứa liposome đều khơng có tính xúc biến hoặc rất ít nếu có và hầu như không bị

ảnh hưởng bởi các yếu tố như KTTP liposome, nồng độ lipid hay tỷ lệ DSPE-PEG. Cả

mẫu HA và HA chứa liposome đều có tính trượt mỏng. Một số kết quả đại diện được

trình bày trong các mục 3.3.1 và 3.3.2.

Ngược lại, các thông số như độ nhớt ở trạng thái nghỉ, tỷ suất trượt mỏng, tần số

giao cắt bị ảnh hưởng mạnh bởi các yếu tố trên. Kết quả được trình bày cụ thể ở mục

3.3.1, 3.3.2 và bảng 3.3.

3.2.1. Tính trượt mỏng (shear – thinning)

Kết quả cho thấy khi tốc độ trượt tăng lên thì độ nhớt của hệ giảm, hệ có tính trượt

mỏng (shear - thinning). Đây là đặc tính lưu biến quan trọng đối với hệ tiêm nội khớp để

bù nhớt, nó thể hiện khi vận động nhẹ nhàng (tương tự chế độ đo liên tục, vận động theo

một chiều) thì độ nhớt của hệ sẽ giảm, sẽ dễ cử động hơn. Tỷ suất trượt mỏng của các hệ

khác nhau là khác nhau và được trình bày ở bảng 3.3.



25



Hình 3.3 Đồ thị thể hiện tính trượt mỏng của (a) gel HA 2,0% và (b) gel HA 2% chứa

liposome 5% DSPE-PEG 2000 (30mM)

3.2.2. Tính xúc biến (thixotropic)

Tiến hành khảo sát các mẫu gel HA và gel HA chứa liposome, kết quả cho thấy

các hệ gel này đều khơng có tính xúc biến hoặc có tính xúc biến rất nhỏ nếu có (minh hoạ

bởi hình 3.7, 3.8, 3.9).



Độ

nhớt

trượt

(Pa.s)



Tốc độ trượt (s-1)

Hình 3.4 Đồ thị đánh giá tính xúc biến của gel HA. Đường cong độ nhớt của giai đoạn 3

(màu xanh lá cây) trùng với đường cong của giai đoạn 1 (màu đỏ) thể hiện hệ gel khơng

có tính xúc biến.

26



Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của độ nhớt theo thời gian khi khảo sát tĩnh xúc

biến của gel HA. Ở giai đoạn 2, có thể thấy rõ rằng độ nhớt trượt của hệ không bị thay

đổi theo thời gian tác dụng của ứng suất trượt.



Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự khơng có tính xúc biến của hệ gel HA, gel HA – liposome

30mM, gel HA – liposome 50mM.

Các hệ gel HA chứa liposome cũng khơng có tính xúc biến (hình 3.9). Ở ứng suất

trượt cao, độ nhớt khơng thay đổi theo thời gian (hình 3.8). Khi giảm dần ứng suất trượt



27



thì hầu như hồi phục hồn tồn. Sự khác biệt nhỏ ở vùng ứng suất trượt thấp có thể là do

độ nhạy của thiết bị tại các vùng này kém hơn so với ở tốc độ trượt cao.

3.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tần số giao cắt, độ nhớt tĩnh, độ nhớt tại tốc độ trượt

250 s-1, tỷ suất trượt mỏng của hệ gel HA và gel HA chứa liposome

Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần cơng thức tới các tính chất lưu

biến của hệ gel HA và gel HA chứa liposome được trình bày trong bảng 3.3:

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá lưu biến của các mẫu gel HA và gel HA chứa liposome

Nồng

độ

HA

(%)



Nồng độ

DPSE –

PEG

2000

(%)

0



1%



5

0

1



5



2%



1



5



5



Tổng

nồng độ

lipid

(mM)



KTTP



0

10

30

50

0

10

30

50

10

30

50

10

30

50

10

30

50

10

30

50

100



0

15,4 µm

15,4 µm

15,4 µm

0

15,8 µm

15,8 µm

15,8 µm

15,0 µm

15,0 µm

15,0 µm

137 nm

137 nm

137 nm

134 nm

134 nm

134 nm

7,7 µm

7,7 µm

7,7 µm

7,7 µm



Độ nhớt

đo ở tốc

độ trượt

250 s-1

(η250

(Pa.s))

0,23

0,27

0,37

0,43

0,74

0,94

1,21

1,63

0,96

1,26

1,74

0,88

1,03

1,24

0,94

1,22

1,80

0,92

1,08

1,32

1,24

28



Tần số

giao

cắt

(Hz)



Độ nhớt

tại trạng

thái

nghỉ

(η0)



Tỷ suất

trượt

mỏng

(η0 /η250)



5,97

5,28

3,57

2,69

1,45

1,18

0,80

0,48

1,11

0,69

0,43

1,19

1,02

0,72

1,19

0,80

0,45

1,18

0,70

0,56

0,24



1,86

4,61

13,98

73,77

40,78

56,67

113,37

224,17

58,99

119,02

297,17

48,42

71,74

163,84

52,09

102,76

265,76

54,44

83,74

155,80

424,50



8,10

16,85

38,13

170,46

54,81

60,33

93,41

137,66

61,35

94,42

170,36

54,94

69,54

131,86

55,48

84,36

148,02

59,43

77,85

118,34

342,34



Nhận xét:

Kết quả đo độ nhớt tĩnh của 2 mẫu gel HA 1,0% và 2,0% lần lượt là 2,86 Pa.s và

40,78 Pa.s; khi nồng độ HA tăng thì độ nhớt tĩnh cũng tăng nhưng tăng với mức độ nhanh

hơn: độ nhớt tăng hơn 14 lần trong khi nồng độ HA chỉ tăng 2 lần. Bên cạnh đó, với bất

kỳ nồng độ HA nào (1,0 hay 2,0%), tỷ lệ mol DSPE-PEG 2000 nào (1,0% hay 5,0%) hay

vùng KTTP nào (134 nm, 7 µm hay 15 µm), độ nhớt tĩnh và độ nhớt ở trạng thái nghỉ của

hệ cũng tỷ lệ thuận với tổng nồng độ lipid (Hình 3.11, 3.12, 3.13). Ngược lại, tần số giao

cắt tỷ lệ nghịch với tổng nồng độ lipid. Mặt khác, khi độ nhớt tăng thì tỷ suất trượt mỏng

cũng tăng theo, giá trị độ nhớt ở 250 s-1 của các hệ gel liposome cũng tỷ lệ thuận với nồng

độ lipid nhưng giá trị tuyệt đối của các mẫu gel liposome ở 250 s-1 không quá khác biệt.

Kết quả trên cho thấy việc điều chỉnh tổng nồng độ lipid sẽ giúp thu được hệ có độ nhớt

và tần số giao cắt giống với dịch khớp sinh lý.





đun

đàn

hồi

G’

(Pa)



đun

nhớt

G’’

(Pa)



Tần số (Hz)

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổ tần số giao cắt theo tổng nồng độ lipid. Tần số giao

cắt của mẫu gel HA chứa liposome nhỏ hơn mẫu gel HA ở cùng nồng độ.



29



Tuy vậy, mức độ thay đổi của các thông số nêu trên khơng chỉ phụ thuộc vào tổng

nồng độ lipid mà còn phụ thuộc vào các thông số khác. Cụ thể:

- Nồng độ HA: khi cố định các thơng số còn lại (KTTP liposome, tổng nồng độ

lipid) mức độ tăng độ nhớt của các mẫu gel chứa liposome có nồng độ HA 1,0% cao hơn

các mẫu trong HA 2,0% (bảng 3.5). Mặt khác, với các gel liposome chứa 2,0% HA, ở các

nồng độ lipid thấp (10-30mM), khi nồng dộ lipid tăng thì độ nhớt bị ảnh hưởng không

nhiều như mẫu HA 1,0%. Mức độ ảnh hưởng của liposome tơi độ nhớt lớn khi ở tổng

nồng độ lipid trong khoảng từ 30 - 50mM.

Bảng 3.4 Bảng so sánh mối tương quan giữa độ nhớt của các mẫu gel chứa liposome

30mM và 50mM so với mẫu 10mM, trong 2 nồng độ gel HA 1,0%, HA 2,0%.

Nồng độ

HA



Độ nhớt tĩnh (Pa.s)

10 mM



30 mM



50 mM



1,0%



100,00%



303,25%



1600,22%



2,0%



100,00%



201,76%



503,76%



- Tỷ lệ mol DSPE-PEG 2000: kết quả tương tự như các nghiên cứu trước đây [20]:

DPSE-PEG 2000 làm tăng độ nhớt của hệ; sự tăng độ nhớt này ở các tổng nồng độ lipid

thấp 10-30mM chưa lớn, khi ở tổng nồng độ lipid cao hơn (50mM) thì mới thấy được sự

chênh lệch độ nhớt rõ nét hơn, đặc biệt là ở gel 2,0% HA.

- Kích thước tiểu phân liposome: khi kích thước tăng giảm từ 7,7 µm xuống khoảng

130 nm thì độ nhớt tăng (ở cả 3 tổng nồng độ lipid khác nhau), giống với kết quả thu

được bởi Naila El Kechai và cộng sự (2015 - [20]) khi khảo sát đặc tính của gel HA chứa

liposome từ phosphatidyl cholin lòng đỏ trứng (EPC). Các tác giả cho rằng KTTP giảm

thì diện tích bề mặt tăng, lượng DSPE-PEG 2000 tiếp túc với HA tăng, do đó độ nhớt của

hệ tăng. Tuy vậy, kết quả kích thước liposome HSPC tăng từ 7,7 µm và 15,0 µm, độ nhớt

tĩnh và độ nhớt ở tốc độ trượt 250 s-1 của hệ tăng, đồng thời tần số giao cắt cũng giảm

xuống (hình 3.11, 3.12). Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là do liposome HSPC

cứng và khó bị biến dạng hơn liposome EPC dưới tác động của ứng suất trượt, gây cản

30



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×