Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
b) Bào chế dung dịch uống chứa l-tetrahydropalmatin (SOL)

b) Bào chế dung dịch uống chứa l-tetrahydropalmatin (SOL)

Tải bản đầy đủ - 0trang

vòng/phút trong 10 phút, thu huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ -19ºC trước khi đưa đi

phân tích LC-MS/MS .

2.3.2.2. Phương pháp chiết

Phương pháp chiết l-THP từ huyết tương thỏ đã được nhóm nghiên cứu phát triển

trước đó. Tiến hành chiết theo quy trình QuEChERS như sau: hút chính xác 0,5 ml huyết

tương cho vào ống ly tâm 2 ml. Thêm 25 µl dung dịch berberin chlorid 1 µg/ml và 0,5

ml acetonitril. Tiến hành lắc xốy trong vòng 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất. Tiếp tục

thêm 0,2 g magnesi sulphat và 0,05 g natri clorid. Lắc xoáy trong vòng 1 phút sau đó ly

tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong vòng 10 phút. Hút lớp dịch lỏng trên cùng để định

lượng bằng phương pháp LC-MS/MS .

2.3.2.3. Phương pháp phân tích trong huyết tương bằng LC-MS/MS

Phương pháp định lượng l-THP trong huyết tương cũng đã được nhóm nghiên cứu

phát triển trước đó, tiến hành định lượng L-THP như sau:

- Sử dụng phương pháp sử dụng chất chuẩn nội (IS): berberin clorid.

- Tiến hành định lượng bằng LC-MS/MS với các điều kiện như sau:

Cột sắc ký: C18 (150 mm × 4,6 mm × 5 μm) và tiền cột C18 của Waters.

Pha động gồm có acetonitril và dd amoniaceat 5mM với chương trình gradient

nồng độ như sau:

Từ phút thứ 0 đến phút thứ 1 acetonitril chiếm 50%. Từ phút thứ 1 đến phút thứ 2

lượng acetonitril tăng từ 50 lến 100%. Lượng acetonitril này được duy trì từ phút thứ 2

đến phút thứ 6. Từ phút từ 6 tới phút 7,5 lượng acetonitril giảm từ 100 % xuống 50% và

được duy trì tới khi chu kỳ kết thúc.

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Thể tích tiêm: 5 µl.

Các thơng số bộ phận phân tích MS được ghi trong phụ lục .

2.3.2.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn định lượng l-THP trong huyết tương thỏ

Chuẩn bị dãy dung dịch chứa l-THP chuẩn có nồng độ từ 5-200 ng/ml và nội chuẩn

Berberin clorid có nồng độ 50 ng/ml được pha loãng bằng dịch chiết huyết tương trắng.

Dịch chiết huyết tương trắng được chuẩn bị bằng 0,5 ml Acetonitril chiết với 0,5

ml huyết tương thỏ tại thời điểm 0 phút. Sau khi hỗn hợp đồng nhất được lắc xoáy 1

21



phút, dung dịch được chiết tách bằng 0,2 g magnesi sulphat và 0,05 g natri clorid và lắc

xốy 1 phút. Lấy lớp dịch trên pha lỗng để thu được dãy dung dịch chuẩn.

Tiến hành tiêm dãy dung dịch chuẩn vào LC-MS/MS để thu được đường chuẩn

định lượng

2.3.3. Phương pháp đánh giá các thông số dược động học

2.3.3.1. Phương pháp tính tốn các thơng số dược động học

Sử dụng phương pháp phân tích dược động học khơng dựa trên mơ hình ngăn với

trợ giúp của NCA (Non-compartmental analysis) trong phần mềm Phoenix 8 để tính

tốn các thơng số dược động học (diện tích dưới đường cong - AUC, thời gian lưu trú

dược chất trung bình - MRT, hằng số thải trừ - λz). Tmax và Cmax thu được dựa vào quan

sát nồng độ l-THP trong huyết tương.

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá mức độ hấp thu hoặc hòa tan in vivo

Với nguyên tắc giải chập đại số đã trình bày ở mục 1.2.3.3, sử dụng toolkit IVIVC

của phần mềm Phoenix 8 để đánh giá mức độ hấp thu hoặc hòa tan in vivo của 3 chế

phẩm xây dựng tương quan. Kết quả được thể hiện dưới dạng hàm số 𝑭𝒗𝒊𝒗𝒐.

2.3.4. Phương pháp đánh giá in vitro

2.3.4.1. Phương pháp định lượng

Tham khảo DĐVN IV, phát triển phương pháp định lượng l-THP trong dung mơi

hòa tan methanol.

Mẫu chuẩn:

- Cân chính xác khoảng 0,05 g l-THP hòa tan vừa đủ trong 100ml methanol được

dung dịch A (dd A).

- Pha loãng dd A bằng mơi trường hòa tan để thu được dãy chuẩn có nồng độ trong

khoảng 10-50 µg/ml.

Mẫu trắng cho mẫu chuẩn là mơi trường hòa tan. Đo độ hấp thụ quang của dãy

dung dịch chuẩn tại bước sóng 281nm.

Mẫu thử: pha lỗng mẫu thử bằng dung mơi ở tỉ lệ nhất định để được nồng độ dung

dịch thử trong khoảng 10-50μg/ml.

Mẫu trắng cho mẫu thử được chuẩn bị tương tự mẫu thử với chế phẩm bào chế là

mẫu placebo không chứa l-THP với các thành phần tương tự mẫu thử.

22



Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 281nm. Xây dựng

đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ độ hấp thụ và nồng độ l-THP để

tính tốn kết quả.

2.3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của mơi trường đến phép thử hòa tan in

vitro

 Chuẩn bị:

- Chuẩn bị 4 mơi trường thử hòa tan khác nhau:

-



Acid hydrocloric 0,1 N



-



Dung dịch đệm phosphat pH 4,5



-



Dung dịch đệm phosphat pH 6,8



-



Nước RO



 Tiến hành thí nghiệm:

Thiết bị: máy thử độ hòa tan loại cánh khuấy.

Điều kiện thử: nhiệt độ 37 ± 0,5ºC , tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút, 900 ml mơi

trường thử được cho vào cốc thử hòa tan.

Cho một lượng mẫu chế phẩm bào chế xây dựng tương quan tương ứng 30 mg lTHP vào cốc thử hòa tan (thời điểm t0 = 0 phút).

5ml dung dịch thử hòa tan được hút ra tại các thời điểm (𝑡𝑛 ) tại 3, 8, 12, 18, 30,

45, 60, 90, 120, 240, 360, 480 phút và bổ sung 5ml môi trường vào ngay sau khi hút

mẫu.

Mẫu được lọc qua giấy lọc thô và được định lượng nồng độ l-THP qua đường

chuẩn bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 281 nm.

 Cách tính kết quả:

𝑛−1



900 ∗ 𝐶𝑡𝑛 + 5 ∗ ∑𝑗=1 𝐶𝑡𝑗

𝑚 𝑡𝑛

% ℎò𝑎 tan =

. 100% =

∗ 100%

𝑚0

𝑚0

Trong đó 𝑚𝑡𝑛 (µg) là tổng khối lượng l-THP hòa tan tích lũy đến thời điểm 𝑡𝑛

𝐶𝑡𝑛 (µg/ml) là nồng độ l-THP trong mơi trường hòa tan tại thời điểm 𝑡𝑛

2.3.4.3. Phương pháp mơ hình hóa đồ thị thử hòa tan in vitro

Sự hòa tan dược chất từ các dạng bào chế có tốc độ giải phóng nhanh, chậm, trung

bình trong từng mơi trường hòa tan được khớp đồng thời với các mơ hình Hill, Weibull,

23



DoubleWeibull, Makoid Banakar. Mơ hình mơ phỏng mức độ hòa tan in vitro tốt nhất

tương ứng với giá trị AIC bé nhất cho cả ba dạng bào chế. Các đồ thị thử hòa tan sau

khi mơ hình hóa được thể diện dưới dạng phương trình hàm số độ hòa tan dược chất

trong môi trường thử theo thời gian (D(Tvitro)) [2].

2.3.5. Phương pháp thiết lập tương quan in vivo – in vitro

2.3.5.1. Phương pháp thiết lập tương quan in vivo – in vitro

Sau khi đã xây dựng được mức độ hấp thu hoặc hòa tan in vivo (𝑭𝒗𝒊𝒗𝒐) và mơ hình

hóa đồ thị thử hòa tan in vitro (D(Tvitro)) của cả 3 chế phẩm bào chế có tốc độ hòa tan

khác nhau, tiến hành xây dựng tương quan (a) giữa mức độ hấp thu in vivo và mức độ

hòa tan in vitro của l-THP và tương quan (b) giữa mức độ hòa tan in vivo và mức độ hòa

tan in vitro của l-THP qua các mơ hình tương quan tuyến tình và phi tuyến tính đã trình

bày ở mục 1.4.3. Mơ hình phản ánh sự tương quan tốt nhất tương ứng với giá trị AIC bé

nhất.

2.3.5.2. Phương pháp thẩm định tương quan in vivo – in vitro

2 mơ hình tương quan (a) và (b) xây dựng trên được sử dụng để tính tốn mức độ

hấp thu in vivo và mức độ hòa tan in vivo theo độ hòa tan in vivo qua các phương trình

tốn học. từ đó, tính tốn tốc độ hấp thu in vivo và tốc độ hòa tan in vivo và tích chập

với hàm số đối chiếu in vivo tương ứng để dự đoán nồng độ dược chất trong huyết tương.

Từ những kết quả dự đoán nồng độ dược chất trong huyết tương, tiến hành tính

tốn AUC và Cmax và so sánh với giá trị AUC và Cmax thực tế.

Tương quan được thẩm định qua sai số giữa kết quả dự đoán và kết quả thực tế của

2 giá trị Cmax và AUC.

%𝑃𝐸𝐶𝑚𝑎𝑥 = |



𝐶𝑚𝑎𝑥𝑜𝑏𝑠 −𝐶𝑚𝑎𝑥𝑝𝑟𝑒𝑑

𝐶𝑚𝑎𝑥𝑜𝑏𝑠



| . 100%



%𝑃𝐸𝐴𝑈𝐶 = |



𝐴𝑈𝐶𝑜𝑏𝑠 −𝐴𝑈𝐶𝑝𝑟𝑒𝑑

𝐴𝑈𝐶𝑜𝑏𝑠



| . 100%



Theo hướng dẫn của FDA, một tương quan hợp lệ khi sai số dự đoán cho từng chế

phẩm phải thấp hơn 15% và sai số trung bình của 3 chế phẩm phải thấp hơn 10% [7], [13].

2.3.6. Phương pháp tính tốn và xử lý kết quả

 Các số liệu thống kê xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel 2013

 Tính tốn nồng độ l-THP trong huyết tương nhờ phần mềm Agilent MassHunter

Quantitative Analysis (for QQQ).

24



 Tính tốn các thơng số dược động học bằng NCA của phần mềm Phoenix 8

 Mơ hình hóa đồ thị thử hòa tan in vitro, xây dựng hàm số mức độ hấp thu hoặc hòa

tan in vivo, thiết lập và thẩm định tương quan in vivo – in vitro bằng Toolkit IVIVC

của phần mềm Phoenix 8.



25



CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu xây dựng tương quan in vivo – in vitro của l-tetrahydropalmatin được

trình bày sơ lược qua các bước sau.

Bào chế chế



Bào chế chế



phẩm xây dựng



phẩm đối chiếu



Sinh khả dụng

chế phẩm đối



tương quan



Sinh khả dụng in



Các dữ liệu thử



vivo



hòa tan in vitro



chiếu



Đường cong hấp



Các đường cong



thu hoặc hòa tan



hòa tan in vitro



in vivo



Phương pháp

đánh giá độ hòa



Tương quan in



Lựa chọn



vivo – in vitro



tan



Lựa chọn



mơ hình tốn



Thẩm định tương quan

in vivo – in vitro

26



Mơ hình hóa







dữ liệu thử hòa tan



tổng các hàm số



Giải chập



Mơ hình hóa với



 Phát triển các công thức bào chế với tốc độ hòa tan khác nhau (nhanh, trung bình,

chậm) và bào chế chế phẩm đối chiếu là dung dịch thuốc tiêm tĩnh mạch và dung dịch

uống.

 Thu dữ liệu nồng độ dược chất trong huyết tương thỏ (dữ liệu sinh khả dụng in

vivo) của các chế phẩm bào chế xây dựng tương quan và tính tốn đường cong hấp thu

hoặc hòa tan in vivo thông qua các chế phẩm đối chiếu tương ứng bằng phương pháp

giải chập đại số.

 Thay đổi phương pháp thử hòa tan để thu được các dữ liệu thử hòa tan in vitro

khác nhau khi thử trên các dạng bào chế xây dựng tương quan.

 Tiến hành xây dựng mơ hình tương quan giữa dữ liệu đường cong hấp thu hoặc

hòa tan in vivo và các dữ liệu thử hòa tan in vitro để đánh giá sự khác nhau giữa các mơi

trường hòa tan khi xây dựng mơ hình tương quan, từ đó chọn ra mơi trường hòa tan phù

hợp nhất cho phép thử hòa tan.

 Trên phương pháp thử hòa tan đã lựa chọn, tiến hành sử dụng các mơ hình tốn

học khác nhau để chọn ra phương trình tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ lTHP trong huyết tương thỏ và dữ liệu thử hòa tan in vitro. Thẩm định các mơ hình tốn

để thu được tương quan đạt tiêu chuẩn của FDA.

3.1. Phương pháp định lượng

3.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng l-THP bằng phương pháp LC-MS/MS

Để tính tốn nồng độ l-THP trong huyết tương thỏ theo thời gian, tiến hành theo

phương pháp đã được mô tả ở phần 2.3.2.4, tiến hành tiêm dãy dung dịch chuẩn và định

lượng bằng phương pháp LC-MS/MS. Dãy dung dịch chuẩn l-THP trong dịch chiết

huyết tương trắng có nồng độ từ 5-200 µg/ml. Xây dựng đồ thị thể hiện mối tương quan

giữa nồng độ l-THP và độ hấp thụ quang. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.



27



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

b) Bào chế dung dịch uống chứa l-tetrahydropalmatin (SOL)

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×