Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
2 Phương pháp nghiên cứu

2 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ - 0trang

(3 acid amin với protein, 11 nucleotid với acid nucleic) và đồng thòi tại nhiều vị



17



trí khác nhau trên cặp phân tử đang nghiên cứu. Để lượng giá mức độ tương đồng,

BLAST sử dụng ma trận tính điểm BLOSUM hoặc PAM. BLAST là cơng cụ tiêu

chuẩn của NCBI để tìm kiếm trong cơ dữ liệu các phân tử có trình tự acid

amin/nucleotid tương đồng với phân tử đang nghiên cứu. Dữ liệu vào của BLAST

gồm có: trình tự acid amin/nucleotid dưới định dạng FASTA, cơ sở dữ liệu sẽ sử

dụng để tìm kiếm, ma trận tính điểm. Dữ liệu ra của BLAST là danh mục các chuỗi

acid amin/nucleotid tương tự như chuỗi nghiên cứu. [2]

Trong nghiên cứu này, NCBI-BLAST được sử dụng để tìm kiếm các protein có

trình tự acid amin tương đồng với protein MefA và MefE. Cơ sở dữ

li ệu dùng để tìm kiếm là Protein Data Bank, các tham số của BLAST được giữ mặc

định. Từ các kết quả thu được, các protein có nguồn gốc từ vi khuẩn và độ tương

đồng cao về trình tự acid amin so với MefA và MefE đ ược chọn ra để nghiên cứu

tiếp.

b) Clustar Omega

Clustar Omega là chương trình máy tính xác định sự tương đồng về trình tự

acid amin/nucleotid của đồng thòi nhiều phân tử. Dữ liệu vào là trình tự acid

amin/nucleotid của các phân tử đang nghiên cứu ở nhiều định dạng khác nhau

(FASTA, Swiss-Prot, Clustal, ...). Dữ liệu ra được biểu thị dưới dạng sơ đồ cây (còn

gọi là cây phân loại hoặc cây phát sinh), trong đó các phân tử có độ tương đồng

càng cao sẽ nằm ở những nhánh càng gần nhau. Việc lập cây phân loại cho phép

nghiên cứu sâu hơn về mức độ tương đồng của các kết quả thu được từ BLAST. [23]

Trong nghiên cứu này, Clustal Omega được áp dụng để phân tích trình tự acid

amin của các protein được chọn ra từ BLAST cùng với MefA và MefE. Các tham số

của Clustal Omega được giữ ở chế độ mặc định.



2.2.3



Xây dựng mơ hình protein MefA và MefE



a) MODELLER

MODELLER là chương trình máy tính để xây dựng cấu trúc bậc ba của phân

tử protein theo phương pháp đồng dạng. Các nghiên cứu cho thấy cấu trúc của

protein có tính bảo thủ cao hơn trình tự acid amin, các protein thuộc cùng một họ

thường có chung các đặc điểm cơ bản về cấu trúc mặc dù khác nhau về nguồn gốc

và trình tự acid amin. Khi đã xác định được cấu trúc chung, cấu trúc này có thể

được sử dụng để làm khn (template) để xây dựng mơ hình của các protein khác

thuộc cùng một họ. Một protein có thể được xây dựng từ một hoặc nhiều khuôn.

Phương pháp đồng dạng được áp dụng nhiều vói các protein màng. Các chương

trình máy tính xây dựng cấu trúc protein theo phương pháp này, ví dụ

MODELLER, thường có kích thước nhỏ, sử dụng ít tài ngun máy tính. [19]

b) Các bước thực hiện



• Tìm phân tử khuôn:

Các phân tử protein thuộc cùng một họ, tương đồng về trình tự acid amin, đã

biết cấu trúc được chọn ra từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank bằng công cụ

BLAST và cây phân loại như đã mơ tả ở phần trước.

• Sắp xếp các đoạn acid amin tương đồng:

Protein khuôn và protein Mef được sắp xếp theo các đoạn acid amin tương

đồng. Việc sắp xếp được thực hiện theo từng cặp phân tử (xây dựng mô hình

từ 1 phân tử khn) bằng mơ đun align2d() của MODELLER, hoặc đồng thời

nhiều phân tử (xây dựng mơ hình từ nhiều phân tử khuôn) bằng mô đun

salign(). Các chương trình máy tính



19



thực hiện việc sắp xếp được viết bằng ngơn ngữ Python và dựa trên chương

trình mẫu của MOD-



ELLER.

• Xây dựng mơ hình protein Mef:

Mơ hình protein Mef được xây dựng bằng mơ đun automodel() của MODELLER. Vói mỗi thí nghiệm, 50 mơ hình phân tử được xây dựng và chọn ra

mơ hình tốt nhất dựa vào chỉ số DOPE để nghiên cứu tiếp.

• Hồn thiện mơ hình protein Mef:

Đoạn nối giữa các cấu trúc bậc hai của Mef được tối ưu hóa bằng chương

trình máy tính ModLoop. ModLoop mô phỏng chuyển động của các nguyên

tử trong đoạn nối ở các nhiệt độ từ cao xuống thấp qua đó tìm vị trí tối ưu

(phương pháp “Simulated annealing”). Dữ liệu vào của ModLoop là mơ

hình phân tử protein dưói định dạng pdb, trình tự và vị trí của các đoạn nối

có chiều dài khơng q 20 acid amin. Dữ liệu ra là 10 mơ hình protein Mef

có cấu hình tối ưu nhất ở định dạng pdb. [8]

Tồn bộ mơ hình phân tử của protein Mef được tối ưu hóa bằng chương

trình máy tính ModRefiner. Q trình được thực hiện theo hai giai đoạn: (1)

tối ưu hóa cấu hình khung C-apha, (2) tối ưu hóa cấu hình các chuỗi bên của

acid amin. Phương pháp tối ưu là mô phỏng động học phân t ử. Dữ liệu vào

của ModRefiner là mơ hình phân tử protein cần tối ưu và dữ liệu ra là mơ

hình protein sau tối ưu, các mơ hình protein này đều ở định dạng pdb. [29]



2.2.4



Đánh giá mơ hình protein Mef



Trong nghiên cứu này, độ tin cậy của mô hình phân tử Mef được đánh giá

bằng 3 phương pháp: đồ thị Ramachandran, ERRAT, và Verify3D. Đây cũng là các

phương pháp được áp dụng để đánh giá mơ hình protein được xây dựng bằng thực

nghiệm.



21







Phương pháp xây dựng đồ thị Ramachandran:

Trong đồ thị Ramachandran, mỗi acid amin trong phân tử protein được biểu

thị bằng một điểm với tọa độ trục tung là góc quay psi và trục hồnh là góc

quay phi của acid amin đó. Một mơ hình protein tin cậy khi có các acid amin

nằm ở vị trí phù hợp trên đồ thị. Các vị trí phù hợp này được xác định qua

cấu trúc của các protein chuẩn. [16, 20]



• Phương pháp phân tích ERRAT:

Phương pháp ERRAT được xây dựng trên nghiên cứu cho thấy trong một

phân tử protein tương tác khơng cộng hóa trị giữa các ngun tử C, N, O của

các acid amin ln có tính quy luật. Để đánh giá độ tin cậy, tương tác C-N-O

của mơ hình protein được phân tích theo từng cụm 9 acid amin liên tiếp

nhau và được so sánh với tham số của 96 cấu trúc protein chuẩn. Một mơ

hình có độ tin cậy cao khi có tham số tương đương protein chuẩn. [5]

• Phương pháp phân tích Verify 3D:

Theo phương pháp Verify3D, phân tử protein được chia thành nhiều khu

vực (gọi là mơi trường) khác nhau theo 3 đặc tính: (1) tổng diện tích chuỗi

bên bị bao phủ bỏi các nguyên tử khác trong protein, (2) phần diện tích chuỗi

bên bị bao phủ bởi các phân tử phân cực hoặc nước, (3) loại cấu trúc bậc hai.

Mỗi môi trường này chỉ phù hợp vói sự có mặt của một số loại acid amin.

Một mơ hình protein có độ tin cậy cao khi phần lớn các acid amin đều nằm

trong môi trường phù hợp. [15]



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN



3.1



Dự đoán cấu trúc bậc hai của protein Mef



Cấu trúc bậc hai của protein MefA và MefE được dự đoán qua chương trình

máy tính TMPred cho cả hai trưòng họp đầu amin của chuỗi acid amin nằm ở bên

ngoài và bên trong của màng tế bào. Kết quả dự đoán cho thấy chuỗi acid amin của

protein Mef chỉ tạo các cấu trúc xoắn alpha. Các xoắn này có chiều dài từ 18 đến 27

acid amin và xếp ngược chiều nhau trong màng tế bào. Với giả thiết đầu amin nằm

bên ngoài màng tế bào, chuỗi acid amin MefA có khả năng tạo 12 đoạn xoắn alpha

(Bảng 1) còn của MefE có khả năng tạo 10 đoạn (Bảng 3). Với giả thiết đầu amin

nằm ở bên trong màng t ế bào, cả MefA và MefE đều có khả năng tạo 11 đoạn xoắn

alpha (Bảng 2, 4).

Bảng 1: Kết quả dự đoán vị trí các xoắn alpha của MefA với giả thiết đầu N nằm ở

bên ngoài màng.

STT



Acid amin đầu

tiên



Acid amin cuối

cùng



Điể

m



Hướng



34



Độ dài

xoắn

24



1



11



1695



o-i



2



43



60



18



1938



i-o



3



76



98



23



2071



o-i



4



100



118



19



1585



i-o



5



146



164



19



1331



o-i



6



169



188



20



1660



i-o



7



220



246



27



1666



o-i



8



264



281



18



1751



i-o



9



285



306



22



2053



o-i



10



309



327



19



2387



i-o



11



347



369



23



1894



o-i



12



378



396



19



2093



i-o



23



Bảng 2: Kết quả dự đốn vị trí các xoắn alpha của MefA với giả thiết đầu N

nằm ở bên trong màng.

STT



Acid amin đầu

tiên



Acid amin cuối

cùng



Điểm Hướng



37



Độ dài

xoắn

19



1



19



1918



i-o



2



45



68



24



1777



o-i



3



76



98



23



2282



i-o



4



101



118



18



1405



o-i



5



169



188



20



1660



i-o



6



220



246



27



1666



o-i



7



264



281



18



1751



i-o



8



285



306



22



2053



o-i



9



309



327



19



2387



i-o



10



347



369



23



1894



o-i



11



378



396



19



2093



i-o



Bảng 3: Kết quả dự đốn vị trí các xoắn alpha của MefE với giả thiết đầu N nằm

ở bên ngoài màng.

STT



Acid amin đầu

tiên



Acid amin cuối

cùng



Điểm Hướng



34



Độ dài

xoắn

24



1



11



1719



o-i



2



43



60



18



1805



i-o



3



82



108



27



2369



o-i



4



169



188



20



1670



i-o



5



220



238



19



1459



o-i



6



257



281



25



1377



i-o



7



285



305



21



1944



o-i



8



309



327



19



2348



i-o



9



347



369



23



2081



o-i



10



373



393



21



2294



i-o



Bảng 4: Kết quả dự đoán vị trí các xoắn alpha của MefE vói giả thiết đầu N

nằm ở bên trong màng.

STT



Acid amin đầu

tiên



Acid amin cuối

cùng



Điểm Hưóng



37



Độ dài

xoắn

27



1



11



1938



i-o



2



45



68



24



1836



o-i



3



76



98



23



2458



i-o



4



146



165



20



1326



o-i



5



169



188



20



1670



i-o



6



220



238



19



1459



o-i



7



257



281



25



1377



i-o



8



285



305



21



1944



o-i



9



309



327



19



2348



i-o



10



347



369



23



2081



o-i



11



373



393



21



2294



i-o



* Chú thích: i: Trong màng

o: Ngồi màng

Giá trị điểm >500 được xem là có ý nghĩa.

3.2

Tìm protein tương đồng



Các protein có trình tự acid amin tương đồng vói Mef được tìm từ cơ sở dữ

liệu Protein Data Bank bằng công cụ NCBI-BLAST. Protein Data Bank là cơ sở dữ

liệu của các protein đã được xác định cấu trúc, các protein chọn ra từ đây sẽ được

sử dụng làm khuôn để xây dựng mơ hình protein Mef. Từ các kết quả thu được,

chúng tôi chọn ra 10 protein khác nhau có độ tương đồng cao nhất vói protein Mef,

mã PDB là: 1PW4, 3WDO, 4LDS, 1PV6, 4ZOW, 2GFP, 4JA3,

4GBY, 5EQG, 4OAA (Bảng 5). Tất cả các protein trên đều thuộc họ MFS, có cấu trúc

gồm các đoạn xoắn alpha xếp ngược chiều nhau; kết quả này phù hợp vói dự đốn

cấu trúc bậc hai của protein Mef.

Trình tự acid amin của 10 protein thu được từ BLAST cùng vói MefA và MefE được

phân tích tiếp bằng bằng phương pháp xây dựng cây phân loại.



25



Theo phương pháp này, các chuỗi acid amin có độ tương đồng càng cao càng nằm ở

những nhánh gần nhau. Kết quả cho thấy MefA và MefE được xếp gần nhất vói



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

2 Phương pháp nghiên cứu

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×