Tải bản đầy đủ - 0trang
- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm ni cấy vi sinh vật: đĩa petri, ống nghiệm,

bông không thấm nước, bình tam giác, cốc đong, phễu lọc, pipet pasteur…Nồi khử

trùng SA-3000VL của hãng STUDY – Đài Loan, box cấy, bếp điện, cân phân tích,

tủ ấm, bộ cấy phiên bản 32 giếng, màng lọc petri film, khoanh giấy lọc khuếch tán.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Xác định các thông số kỹ thuật tách và thu nhận VCO từ sữa dừa

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu quả tách ly tâm

+ Tốc độ ly tâm cố định 21.000vòng/phút

+ Nhiệt độ khảo sát ở 300C, 350C, 400C, 450C và 500C, lựa chọn nhiệt độ thích hợp

thơng qua việc xác định các thông số: Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo (%)

Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)

Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)

+ Thời gian ly tâm 10 phút

- Xác định tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 1

+ Lấy 30 lít sữa dừa cho 1 lần thí nghiệm

+ Nhiệt độ sữa dừa: 450C

+ Tốc độ ly tâm khảo sát ở 9.000vòng/phút , 12.000vòng/phút, 15.000vòng/phút,

18.000vòng/phút và 21.000 vòng/phút

+ Xác định tốc độ ly tâm thích hợp thông qua đánh giá các chỉ số:

Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo (%) so với lượng sữa dừa.

Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)

Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)

+ Thời gian ly tâm 15 phút

- Xác định tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 2

+ Lấy 10 lít dầu đã được tách ở lần 1 cho 1 lần thí nghiệm.



30



+ Tốc độ ly tâm khảo sát ở 12.000vòng/phút , 15.000vòng/phút, 18.000vòng/phút,

21.000vòng/phút và 24.000 vòng/phút.

+ Xác định tốc độ ly tâm thích hợp thơng qua đánh giá các chỉ số:

Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo (%) so với lượng dầu thu lần 1

Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)

Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)

+ Thời gian ly tâm 25 phút

- Xác định tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 3

+ Lấy 10 lít dầu đã được tách ở lần 2

+ Tốc độ ly tâm khảo sát ở 12.000vòng/phút , 15.000vòng/phút, 18.000vòng/phút,

21.000vòng/phút và 24.000 vòng/phút.

+ Xác định tốc độ ly tâm thích hợp thông qua đánh giá các chỉ số:

Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo (%) so với lượng dầu thu lần 2

Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)

Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)

+ Thời gian ly tâm 35 phút

+ Thông số đánh giá tỷ lệ nước trong dầu (độ ẩm) được coi là quan trọng nhất

- Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần

2.3.2. Phương pháp vật lý

2.3.2.1.Xác định tỷ lệ thu hồi dầu

Tỷ lệ thu hồi dầu (Yo) được tính bằng % lượng dầu (pha lỏng nhẹ) thu được

sau khi tách pha so với khối lượng nguyên liệu đưa vào tách, được tính bằng cơng

thức:

% Yo = Mo/ Mm x 100

Trong đó: Mo là khối lượng pha dầu thu được (kg), Mm là khối lượng nguyên liệu

(kg).



31



2.3.2.2.Phương pháp xác định độ ẩm của dầu

Xác định độ ẩm của dầu dừa theo TCVN 6120:1996 [6]

Mẫu được sấy ở 105oC ít nhất 7 h rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình

hút ẩm cho đến khi khối lượng khơng đổi. Cân và tính hàm ẩm theo cơng thức:

Wo (%) =



𝐺1 − 𝐺2

𝐺1



x 100



Trong đó:

- Wo là hàm ẩm trong dầu.

- G1 là khối lượng mẫu (dầu) trước khi sấy.

- G2 là khối lượng mẫu sau khi sấy và làm nguội.

2.3.3. Phương pháp hóa lý

- Xác định hàm lượng dầu có trong sữa dừa theo phương pháp của Gerber [13].

- Xác định axít béo tự do trong dầu dừa theo TCVN 6127:1996 [5]

Cân chính xác 10g dầu dừa cho vào bình cầu 200ml, thêm 50ml



dung mơi



hỗn hợp dietyl este/etanol 95% (v:v = 1:1), lắc đều đến khi hòa tan hồn toàn, cho 2

giọt chỉ thị phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N trong cồn cho

đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng tươi và màu không mất đi sau 30 giây.

*Tính kết quả

Độ axít được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm theo cơng thức:

M

100

𝑉 ×𝑐 ×𝑀

×

×𝑐 ×𝑉 =

1000

𝑚

10 ×𝑚

Trong đó:

V: thể tích của dung dịch chuẩn KOH đã sử dụng (ml)

C: là nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn KOH đã sử dụng (mol/l)

m: khối lượng phần mẫu thử (g)

M: khối lượng mol của axít được chọn để biểu thị kết quả (g/mol) (đối với

dầu dừa độ axít được biểu thị theo axít lauric khối lượng mol: 200 g/mol).



32



- Xác định chi số Peroxide theo TCVN 6121:1996 [7]

Ngun lý: Trong mơi trường axít, peroxide giải phóng iod từ muối KI ở nhiệt độ nóng

hoặc lạnh. Chuẩn độ iod giải phóng ra thể tự do bằng dung dịch Natri Thiosulfate

(Na2S2O3).



2 Na2S2O3 + I2  2NaI + Na2S4O6

Thực hiện:

a)



Thuốc thử

- Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay)

- Chỉ thị hồ tinh bột 1%.

- Dung dịch Na2S2O3 0,01N (pha trước khi dùng từ dung dịch Na2S2O3 0.1N

bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa CO2).



b)



Cách xác định:

Lấy 2 bình nón dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2g dầu, bình



2 (bình kiểm tra) 2ml nước cất. Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axít

axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1ml dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể KI), đậy

nút. Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm 25ml nước cất. Cho

thêm 0,5ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch

Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh

c)



Tính kết quả :

PV  0,01269.(a  b) x100

m



a-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình thí nghiệm.

b-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình kiểm tra.

m-khối lượng chất béo.

0,01269-số gam iod tương đương với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N.



33



- Xác định hàm lượng các axít béo của VCO bằng phương pháp sắc ký khí ghép

khối phổ [4]

Tiến hành:

1. Lấy 10mg dầu dừa được hoà tan với 1ml n-hexan lắc, kĩ trong lọ nhỏ nút kín.

2. Bổ sung 25 l dung dịch CH3ONa trong metanol (2mol/l) và lắc kĩ trong 1 phút.

3. Bổ sung 1ml H2O cất vào, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Hút

lớp sáp khơng phản ứng ở dưới loại đi.

4. Bổ sung 100l HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút.

5. Loại bỏ kiệt lớp bẩn dưới đáy, lớp dung môi trên được làm khan bằng Na2SO4 và

phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút.

6. Chuyển mẫu đã metyl hố sang ống mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng

máy sắc kí khí: HP-6890, ghép nối với Mass Selective Detector Agilent 5973;

- Cột:HP-5MS (0.25(m*30m *0.25mm).

- Khí mang He.

- Chương trình nhiệt độ: 80 (1min.) - 40/ min -150 (1min) - 10/min - 260

(10min).

Sử dụng thư viện phổ khối: WILEY275.L và NIST 98.L.

2.3.4. Đánh giá chất lượng của VCO

Đánh giá chất lượng VCO thơng qua phân tích các chỉ tiêu:

- Độ ẩm, hợp chất dễ bay hơi theo TCVN 6120:1996

- Axít béo tự do theo TCVN 6127:1996

- Chỉ số peroxyt theo TCVN 6121:1996

- Tỷ trọng, chỉ số khúc xạ ở 40oC theo TCVN 2640:1999



- Tạp chất không tan theo TCVN 6122:1996

- Độ xà phòng hóa theo TCVN 2638:1993

- Chỉ số Iot,% các chất khơng xà phòng hóa bởi khối lượng theo TCVN 6122:1996

- Vi sinh vật tổng số theo TCVN 7923:2008



34



- Hàm lượng kim loại nặng theo TCVN 6352:1998

2.3.5. Xác định khả năng thủy phân của dầu dừa bởi enzyme lipase

Cân 50g VCO, bổ sung 50ml nước, tiếp đó cho 12,5 ml dung dịch CaCl2

0.063M và 25ml dung dịch đệm Tris – HCl và sau cùng cho 500mg enzyme lipase.

Hỗn hợp được đồng nhất bằng máy khuấy từ và lắc ở 200rpm trong thời gian 10

phút. Sau đó ủ ở 550C và lắc mỗi giờ 10 phút ở 200rpm. Quan sát sự gia tăng trị số

axít 2 giờ/lần trong vòng 18 giờ.

Trị số axít được thực hiện với VCO và VCOH

Cân 5g dầu dừa và chuyển vào bình erlen 200ml, bổ sung thêm 25ml ethanol

95% và lắc đều. Đun cách thủy trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc đều. Chuẩn độ bằng

dung dịch KOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalein. Trị số axít béo được tính theo cơng

thức sau:

AV =



A x N x 56,1

m



(mg KOH/g VCO)



Trong đó:

A: Thể tích KOH chuẩn độ được (ml)

N: Nồng độ dung dịch KOH

m: Khối lượng dầu đem phân tích (g)

2.3.5.1. Xác định khả năng ức chế vi khuẩn của dầu dừa

Nguyên lý: Dầu dừa sẽ được khuếch tán vào trong mơi trường thạch có chứa

vi khuẩn kiểm định. Nếu có hoạt tính, vi khuẩn sẽ khơng thể phân tán và tạo thành

vòng tròn trong suốt (vòng vơ khuẩn). Hoạt tính kháng khuẩn sẽ được xác định nhờ

vào đường kính vòng vơ khuẩn.

Tiến hành:Lấy 100 µl dịch vi khuẩn kiểm định đã được nuôi 24 giờ, lắc với

tốc độ 100 rpm ở môi trường BHI lỏng (đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus) và

môi trường MH lỏng (đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa), tra đều trên đĩa

petri chứa môi trường BHI thạch (đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus) và môi

trường MH thạch (đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa). Đặt các khoanh giấy



35



kháng sinh (đường kính 6mm, sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản

xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên

thạch, các khoanh giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều

kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 80C hoặc -200C ) đã được tẩm 20 µl VCO và

VCOH ở 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 giờ lên đĩa petri đã cấy trải vi khuẩn. Sau đó

lật úp đĩa thạch và ni ở 370C trong 24 giờ.

Đọc kết quả:

Hoạt tính kháng khuẩn (mm) = Đường kính vòng vơ khuẩn (D) – đường kính giấy

lọc (d).

Thí nghiệm được lập lại 3 lần.

2.3.5.2. Xác định điều kiện bảo quản của dầu dừa đối với độ bền hoạt tính

kháng khuẩn Staphylococcus và Pseudomonas aeruginosa

Mẫu VCO được bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau các mốc thời gian 0, 3 và 6

tháng, VCO được đem ra tiến hành xác định khả năng ức chế đối với 2 vi khuẩn

Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa.

2.4. Phương pháp phân tích xử lý sớ liệu

Các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm SPSS để phân tích giá trị trung

bình, độ lệch chuẩn, các kết quả khác nhau có ý nghĩa và khơng có ý nghĩa.



36



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Nghiên cứu chiết tách VCO từ sữa dừa.

3.1.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu quả tách ly tâm

Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu quả tách ly tâm được

thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất tách ly tâm

Nhiệt độ sữa dừa lúc ly tâm (oC)

Chỉ tiêu

30



35



40



45



50



Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo (%)



15,36



14,53



14,09



13,98



14.2



Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)



17,13d



8,3c



4,16b



2,5a



2,4a



Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)



2,54



1,79



1,57



1,41



1,4



Ghi chú: a,b,c,d là biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa và khơng có ý nghĩa

Nhận xét:

- Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, khi tăng nhiệt độ, độ nhớt của sữa dừa giảm

đi do đó tốc độ tách tăng lên, hiệu quả tách cũng tăng lên. Điều này thể hiện rõ ở tỷ

lệ nước trong dầu (Wo) giảm đi rõ rệt. Mặt khác, không thấy tỷ lệ thu hồi pha dầu

(pha lỏng nhẹ, một trong 2 pha do máy ly tâm tách ra) tăng lên mà ngược lại giảm

đi, đó là do hàm lượng nước trong pha dầu giảm quá lớn, kéo theo sự giảm thể tích

của cả pha. Đồng thời với việc giảm tỷ lệ nước trong dầu (pha lỏng nhẹ) Wo , tỷ lệ

dầu trong pha nước (pha lỏng nặng) Ow cũng giảm theo.

- Ở nhiệt độ 500C tỷ lệ nước trong dầu có sự khác biệt nhưng khơng có ý nghĩa

so với ở nhiệt độ 450C mặt khác ở nhiệt độ này một số hoạt chất của VCO có nguy

cơ bị biến tính, ảnh hưởng đến giá trị của VCO. Vì vậy lựa chọn nhiệt độ 450C cho

nghiên cứu tiếp theo

3.1.2. Xác định ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 1

Kết quả xác định ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 1 được

thể hiện ở bảng 3.2



37



Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 1

Tớc độ quay ly tâm (vòng/phút)

Chỉ tiêu

9000



12000



15000



18000



21000



Tỷ lệ thu hồi pha dầu Yo(%)



9,49



13,22



14,73



14,56



13,99



Tỷ lệ nước trong dầu Wo (%)



16,40



4,92



2,55



2,53



2,50



Tỷ lệ dầu trong nước Ow (%)



7,85



2,66



0,55



0,74



1,40



Nhận xét:

Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy:

- Chất lượng của pha dầu (pha lỏng nhẹ) phụ thuộc rất nhiều vào tỷ lệ nước

chứa trong dầu Wo. Tỷ lệ thu hồi pha lỏng nhẹ (dầu) tăng lên theo chiều tăng của

tốc độ ly tâm. Sau mốc 15.000 vòng/phút giảm xuống.

- Tỷ lệ nước trong pha lỏng nhẹ và dầu trong pha lỏng nặng giảm đi theo chiều

tăng của tốc độ ly tâm, nhưng khi tốc độ ly tâm tăng đến một mức nào đó (q

15.000 vòng/phút) thì cho hiệu quả ngược lại.

- Tỷ lệ nước trong pha lỏng nhẹ tiếp tục giảm nhẹ nhưng hàm lượng dầu trong

pha lỏng nặng tăng lên, bởi vì khi pha dầu đã đạt được nồng độ cao (chiếm đến trên

97%, nước chỉ còn dưới 2,55%) thì dầu bị lực ly tâm đẩy vào pha nước, tổn thất dầu

tăng lên, có nghĩa là hiệu quả tách từ sau 15.000 vòng/phút giảm đi. Điều này cũng

giải thích vì sao tỷ lệ thu hồi pha dầu giảm đi. Điều quan trọng nhất là tỷ lệ nước

trong pha dầu xuống đến mức chấp nhận được cho đợt ly tâm đầu tiên, từ 2,50%

đến 2,55%, khi tốc độ ly tâm đạt và vượt ngưỡng 15.000 vòng/phút. Vì vậy tốc độ

ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 1 thích hợp là 15.000 vòng/phút.

3.1.3. Xác định ảnh hưởng của tớc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 2

Kết quả xác định ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới hiệu quả tách dầu lần 2 được

thể hiện ở bảng 3.3



38