Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
Phương pháp này thường tạo ra các hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó cần làm nhỏ kích thước hạt sau điều chế. Hỗn dịch sản phẩm được đồng nhất hóa với áp suất và chu kỳ thích hợp để giảm kích thước liposome. Bảo quản sản phẩm ở 2-8C.

Phương pháp này thường tạo ra các hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó cần làm nhỏ kích thước hạt sau điều chế. Hỗn dịch sản phẩm được đồng nhất hóa với áp suất và chu kỳ thích hợp để giảm kích thước liposome. Bảo quản sản phẩm ở 2-8C.

Tải bản đầy đủ - 0trang

Hình 5.9 Sơ đồ điều chế liposome bằng phương pháp

hydrat hóa lớp màng lipid



5.5 Đánh giá hệ phân tán nanoliposome

5.5.1 Tính chất

- Hệ nanoliposome trước đơng khơ: Hệ phân tán trong, màu vàng rất nhạt và đồng



nhất.

- Hệ nanoliposome sau đông khô: Bánh đông khô đẹp, màu vàng nhạt, bề mặt mịn,



thời gian phân tán lại 10-20 giây.



- Hình thức cảm quan sau khi phân tán lại: Hỗn dịch có màu vàng nhạt, khơng có



lắng cặn tinh thể, khơng có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát được

bằng mắt thường.

Theo nghiên cứu tài liệu [53], manitol được đánh giá là một tá dược tạo khung

tốt, hay được sử dụng trong đông khô. Ở nồng độ khoảng 10%, manitol kết tinh ở

dạng tinh thể anhydro manitol và hình thành hỗn hợp eutectic với đá có nhiệt độ

chảy cao (-1,5°C) nên có thể dễ dàng làm khơ, rút ngắn thời gian đông khô, các

dược chất ở dạng vô định hình cũng có thể bao ở bên ngồi các tinh thể manitol

giúp cho thuốc ổn định hơn. Manitol còn tạo được mạng tinh thể mang dược chất ở

dạng vô định hình làm cho bánh đơng khơ có hình thức đẹp, dễ hòa tan trở lại. Như

vậy lựa chọn manitol làm tá dược tạo khung đề bào chế liposome hoàn tồn phù

hợp.



Hình 5.10 Liposome trước và sau đơng khơ

5.5.2 Ảnh TEM, DLS và thế zeta của liposome

Hệ liposome sau khi điều chế sẽ được đánh giá qua kính hiển vi điện tử truyền

qua (TEM), kích thước và phân bố kích thước (DLS) cũng như xác định thế zeta của

tiểu phân để xác định kích thước cũng như độ ổn định của hệ bởi vì những yếu tố

này rất quan trọng trong việc quyết định khả năng hướng đích thụ động qua hiệu

ứng EPR cũng như khả năng hấp thu và đào thải của sản phẩm. Trong khi đó thế

zeta sẽ chứng minh quá trình bề mặt âm điện hạn chế khả năng gây độc của hệ chất

mang .



Tần suất xuất hiện (%)



Hình 5.11 Ảnh TEM của liposome trước đơng khơ ở các thang đo100 nm (trái)

và 200 nm (phải)



10

15

5

0

0.1



1



10



100



1000



Kích thước (nm)

20



100 nm



200 nm



Hình 5.12 Ảnh TEM của liposome sau đơng khô ở các thang đo 100 nm (trái) và

200 nm (phải)



Tần suất xuất hiện (%)



12 -8



-



4 0 0.1



1



10



100



1000



Kích thước (nm)



10000



10000



Hình 5.13 Dải phân bố kích thước của hệ liposome trước (trái)

và sau đơng khơ (phải)

Bảng 5.10 Kích thước và phân bố kích thước của liposome

Mẫu

Liposome trước đơng khơ

Liposome sau đơng khơ



KTTB (nm)

164 ±77,5

167±39,1



PDI

0,277±0,012

0,286±0,051



Sau khi phân tích ảnh chụp của kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, ta thấy

rằng hạt liposome trước đơng khơ có kích thước 50-100 nm, khá đồng đều, có dạng

hình cầu, thấy số màng lipid kép bao bọc xung quanh tiểu phân, liposome ít bị phá

vỡ, tiểu phân liposome khơng bị kết tụ. Quan sát hình ảnh chụp TEM sau đơng khơ

thấy hệ liposome có hình cầu, KTTP không thay đổi nhiều so với trước đông

khô cho thấy quy trình đơng khơ thể có tác dụng bảo vệ tốt cho liposome. Mặt

khác, kết quả DLS đã chứng minh kích thước trung bình của tiểu phân

nanoliposome trước đông khô là 164 nm với chỉ số đa phân tán PDI là 0,277, kiểu

phân bố 1 đỉnh và sau đông khô là 167 nm với chỉ số đa phân tán là 0,286 cũng có

kiểu phân bố 1 đỉnh (hình 5.13). Cả hai phân bố kích thước này đều đạt mục tiêu đề

ra 100 – 200 nm. Kích thước hạt nanoliposome trước và sau đơng khơ mặc dù có

xu hướng tăng (từ 164 nm tăng lên 167 nm) nhưng không đáng kể, chỉ số đa phân

tán của hệ trước và sau đơng khơ nhỏ (PDI < 0.3). Từ đó cho thấy thêm chất bảo vệ

trong q trình đơng khơ giúp bảo vệ tốt cấu trúc liposome, làm tăng sự đồng nhất

của mẫu trong q trình đơng lạnh. Điều này có thể giải thích là do các tá dược bảo

vệ thay thế nước tương tác với phospholipid thông qua liên kết hydro để giúp

liposome khơng bị nứt vỡ trong q trình đơng lạnh và hydrat hóa trở lại. Tá dược

bảo vệ tương tác với đầu phân cực của phospholipid giúp duy trì khoảng cách

giữa các đầu phân cực và giảm lực Vander Waals giữa các chuỗi acyl của

phospholipid. Nhờ đó tá dược bảo vệ làm giảm sự tương tác giữa nước và

phospholipid rồi sau đó thay thế nước. Các liên kết hydro giữa tá dược bảo vệ và

lipid được hình thành trên bề mặt của lớp màng kép. Một phân tử đường có thể

tương tác với tối đa ba lipid khác nhau cùng lúc. Thứ tự ưu tiên các nhóm của

lipid tạo liên kết hydro với nhóm -OH của đường là: phosphate, methyl choline,

cacbonyl. Vì vậy, nhóm phosphate trên lớp màng lipid kép là vị trí có khả năng



nhất mà đường tương tác. Tóm lại, tương tác trực tiếp giữa phospholipid và tá

dược bảo vệ qua liên kết hydro đóng vai trò quan trọng trong q trình đơng khơ

liposome [50, 54].



-4,6 mV



-78,6 mV



Hình 5.14 Thế zeta của liposome: (trái) trước đơng khơ; (phải) sau đơng khơ

Bên cạnh đó, gía trị thế zeta được xem là một trong những tiêu chuẩn cho biết

sự ổn định và có tác dụng ngăn cản sự kết tụ của các tiểu phân. Kết quả thu được

cho thấy thế zeta đo được ở mẫu nanoliposome trước đông khô là -4,6 mV. Nguyên

nhân thế zeta âm là do cấu trúc của CTAB có một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước

trong đó đầu kỵ nước bị lơi kéo vào màng lipid kép của liposome thông qua tương

tác ưa nước-kỵ nước và đầu ưa nước đưa ra bên ngồi hay nhóm amine dương điện

đưa ra ngồi, tương tự như một hạt có các điện tích dương đưa ra ngồi. Đầu còn lại

của CTAB mang điện tích âm nên chúng phủ bên ngoài hạt và kết quả làm thế zeta

mang giá trị âm. Mặt khác, sau đông khô thế zeta là -78,6 mV, điều này là do trong

quá trình đơng khơ liposome, do có thêm chất bảo vệ màng lipid là manitol có nhiều

nhóm -OH làm cho điện tích bề mặt liposome sau đông khô càng âm so với ban

đầu. Theo nghiên cứu tài liệu, điện tích bề mặt liposome càng âm sẽ giảm khả năng

gây độc tế bào và giá trị thế zeta chứng minh hệ liposome ổn định khi thế zeta >

+30 mV hoặc < -30 mV. Kết quả trên hoàn toàn phù hợp.



5.6 Độ ổn định vật lý của hệ liposome

5.6.1 Tính chất: hệ phân tán trong, màu vàng rất nhạt, đồng nhất và không xuất

hiện các hiện tượng kém bền. Do vậy về tính chất mẫu khơng có sự khác biệt ngay

sau khi điều chế và sau 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C.

5.6.2 Kích thước và phân bố kích thước, thế zeta của liposome

Kích thước và phân bố kích thước của hệ liposome sau 4 tuần bảo quản ở nhiệt

độ 2-8°C được trình bày trong bảng 5.11 và hình 5.15



-76,3 mV



Hình 5.15 DLS (trái) và thế zeta (phải) của liposome sau 4 tuần bảo quản



Bảng 5.11 Các giá trị KTTB và chỉ số đa phân tán của hệ nanoliposome sau 4 tuần

bảo quản

Mẫu



Thời gian



Nanoliposome Ban đầu

Sau 4 tuần



KTTB

(nm)

168±39,1

160±29,3



PDI



Thế zeta

(mV)

0,286±0,015 -78,6±0,26

0,271±0,213 -76,3±0,43



Do giới hạn về thời gian nên đề tài chỉ khảo sát độ ổn định của hệ liposome

sau 1 tháng bảo quản ,được đánh giá qua kết quả DLS và thế zeta. Dựa vào kết quả

cho thấy kích thước trung bình của hệ phân tán liposome thay đổi còn 160 nm với

đỉnh 1 có kích thước 174 nm, đỉnh 2 có kích thước 35,3 nm chiếm 7% (hình 5.15).

Mặc dù có kiểu phân bố 2 đỉnh nhưng chỉ số đa phân tán PDI nhỏ khoảng 0,271 (<

0,3), kích thước trung bình có thay đổi nhưng không đáng kể, thế zeta vẫn âm điện

và gần với giá trị ban đầu chứng tỏ hệ liposome vẫn ổn định trong thời gian bảo

quản. Chính vì vậy đề tài chọn công thức này để tiếp tục nghiên cứu q trình nang

hóa thuốc PTX vào liposome.

5.7 Tổng hợp nanoliposome nang hóa PTX bằng phương pháp hydrat hóa lớp

màng mỏng lipid

5.7.1 Tối ưu hóa cơng thức nang hóa thuốc PTX

Kết quả khảo sát hàm lượng PTX được nang hóa vào liposome được trình bày

cụ thể trong bảng 5.12

Bảng 5.12 Kết quả khảo sát hàm lượng PTX đươc mang vào liposome

Công thức

19

20

21

22

SL (mg)

500

500

500

500

CHOL (mg)

56

56

56

56

CTAB (mg)

5

5

5

5

Tween 80 (mg)

80

80

80

80

PTX (%)

1

5

10

15

CHCl3/MeOH (ml)

5

5

5

5

Nước cất (ml)

15

15

15

15

Nhiệt độ hydrat hóa (°C)

60

60

60

60

Cảm quan

Trong Trong

Hơi đục

Đục

Độ ổn định sau 1 tuần

Lắng cặn

Lắng cặn

Từ kết quả ta thấy tỷ lệ paclitaxel chiếm 1% và 5% có độ ổn định và cảm

quan tốt. Liposome mang càng nhiều thuốc thì càng lắng cặn. Tuy nhiên, đề tài

chọn công thức liposome với paclitaxel 5% bởi vì khả năng mang thuốc càng cao

giúp cho hệ nanolipsome PTX có nhiều tiềm năng hơn trong việc thương mại hóa

sản phẩm. Chính vì vậy đề tài chọn PTX 5% tổng khối lượng chất mang để tiến

hành phân tích và khảo sát khả năng giải phóng thuốc.



 Quy trình tổng hợp liposome nang hóa thuốc PTX sau khảo sát



-



Dung dịch 1: Cân chính xác khối lượng các thành phần gồm 500 mg SL, 56 mg

CHOL, 5 mg CTAB cho vào bình cầu 100 ml. Hòa tan các thành phần trên vào 5ml

dung môi CHCl3/MeOH (2:1, v/v).



-



Dung dịch 2: Cân 32 mg PTX hào tan với 5 ml dung mơi CHCl3.



-



Hòa tan dung dịch 1 và dung dịch 2, khuấy nhẹ để hỗn hợp được đồng nhất.



Tiến hành cô quay hỗn hợp trên ở nhiệt độ 45°C trong vòng 4 giờ. Điều chỉnh áp

suất chân khơng để dung môi bay hơi từ từ , không quá nhanh tạo lớp màng lipid

mỏng và trong suốt bám xung quanh thành bình .Tiếp tục để n trong chân khơng

qua đêm để loại hồn tồn lượng dung mơi còn dư.

tan trong 5ml CHCl3/MeOH (2:1)32 mg PTX+ 5 ml CHCl3

500 mg SL, 5 mg CTAB và 56 mgHòa

CHOL

- Khi đã tạo được lớp màng lipid khơ hồn tồn, hỗn hợp cần được hydrat hóa với 15

ml nước chứa 80 mg Tween 80 ở nhiệt độ 60°C đến khi lớp màng lipid mỏng bong

ra hết khỏi thành bình, làm lạnh nhanh hỗn dịch thu được.

Nhiệt độ: 45C

- Phương pháp này thường tạo ra các

hạt

liposome

đa

lớp





kích thước lớn, do đó

Cơ quay tạo phim lipid

Thời gian: 4h

cần làm nhỏ kích thước hạt sau điều chế. Hỗn dịch sản phẩm được đồng nhất hóa

với áp suất và chu kỳ thích hợp để giảm kích thước liposome.

15- mlTiến

nước

cất ly

chứa

Tween

80

Nhiệt

độ: 60C

hành

tâm80

vớimgtốc

độ 5500

v/p hóa

trongtạo

30liposome

phút để loại PTX

khơng

được nang

Hydrat

-



-



hóa vào liposome. Khi đó PTX tự do sẽ nổi lên trên bề mặt hỗn dịch. Lấy lớp trên

hòa tan với dung mơi acetonitril. Đo HPLC để xác định lượng thuốc PTX không

Chu kỳ:5

được nang hóa.

Đồng nhất hóa

Áp suất: 800 bar

Hỗn dịch còn lại đem đông khô với đường manitol 10% và được bảo quản ở nhiệt

độ 2-8°C.

Tốc độ: 5500 v/p

Ly tâm loại thuốc

Thời gian: 30 ph

tự do



Đông khô với manitol 10%



Bột liposome (Bảo quản 2-8C)



Hình 5.16 Sơ đồ tổng hợp liposome nang hóa PTX



5.7.2 Đánh giá hệ phân tán liposome PTX

a. Tính chất

Hệ phân tán liposome paclitaxel lỏng màu vàng rất nhạt, đồng nhất, khơng có

xảy ra hiện tượng kém bền như kết bông, nổi kem, lắng cặn và tách lớp. Bột đông

khô mịn và xốp. Ngoài ra hệ phân tán liposome paclitaxel sau đơng khơ cũng dễ

dàng phân tán hồn tồn vào trong môi trường nước.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Phương pháp này thường tạo ra các hạt liposome đa lớp và có kích thước lớn, do đó cần làm nhỏ kích thước hạt sau điều chế. Hỗn dịch sản phẩm được đồng nhất hóa với áp suất và chu kỳ thích hợp để giảm kích thước liposome. Bảo quản sản phẩm ở 2-8C.

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×