Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ - 0trang

Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Chúng tơi sử dụng thành phần đệm chiết đã được nghiên cứu lựa chọn

theo các nghiên cứu trước. Trong quy trình tách chiết mới, chúng tôi sử dụng

nguyên liệu chiết enzyme từ lá Xuân Hoa tươi để ở -20 0C trong 24 giờ. Quy

trình cũ khi dùng tươi xay nhuyễn có độ nhớt cao, dịch xanh nhiều diệp lục

nên hoạt tính enzyme thấp và khó tinh sạch.

Tủa ethanol (2) được hòa lại trong đệm P. Sorensen 0,001M (dịch 3).

Chúng tôi tiến hành loại chất màu, và các tạp chất khác bằng gel Ca3(PO4)2.

Cho dịch hòa tủa hấp thu vào gel, lắc đều, ly tâm thu dịch, tiếp tục như vậy

cho đến khi dịch enzyme trở nên trong và có màu vàng nhạt (dịch 4). Dịch

chiết enzyme sau khi qua gel Ca3(PO4)2 có độ sạch tăng lên 2,76 lần.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử đã dụng các cột sắc ký khác với

các nghiên cứu trước để lựa chọn được quy trình tinh sạch protease hiệu quả.

Trước khi tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, dịch enzyme phải

được loại muối và cân bằng với đệm P. Sorensen 0,01M. Với mục đích loại

muối và cơ đậm để giảm thể tích dịch enzyme khi cho qua cột sắc ký, chúng

cơ đặc thể tích ban đầu bằng cách cho qua cột amicon ultra centrifugal filter.

Dịch enzyme được làm đậm đặc và cho qua cột lọc gel Sephadex G-100 như

mô tả trong phần phương pháp. Đồ thị biểu diễn quá trình làm sạch protease

trên cột lọc gel được trình bày trên hình 3.2. Để xác nhận phân đoạn nào có

hoạt tính protease, tất cả các phân đoạn đều được kiểm tra hoạt tính protease

bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả cho thấy có 2 đỉnh protein chính

trong đó đỉnh 1 ra ở những phân đoạn gần đầu cho hoạt tính protease cao.

Hoạt tính protease có từ phân đoạn từ ml thứ 25 đến ml thứ 60, cao nhất ở

phân đoạn 35-40 (hình 3.2, bảng 3.1). Phân đoạn còn lại có nồng độ protein

cao nhưng khơng thấy hoạt tính protease, điều này chứng tỏ protein khơng

mong muốn đã được loại bỏ sau khi qua cột lọc gel khá nhiều (hình 3.2).



Hồng Thị Trang



28



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Vùng có hoạt

tính protease



Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn protein protease từ lá cây Xuân Hoa sau khi

qua cột lọc gel Sephadex G-100. Kích thước cột (65 x 1,6 cm), tốc độ dòng

chảy 0,5ml/ phút, phân đoạn được thu 5 ml/ phân đoạn.

Bảng 3.1. Kiểm tra hoạt tính protease của từng phân đoạn qua cột

Sephadex G-100

Phân đoạn



Thứ tự (ml)



Hoạt tính

protease (OD

750nm)



Hồng Thị Trang



1



15-20



0.0



2



20-25



0.01



3



25-30



0.218



4



30-35



0.652



5



35-40



0.9



29



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



6



40-45



0.765



7



45-50



0.478



8



50-55



0.437



9



55-60



0.081



10



60-65



0.02



11



65-70



0.012



12



70-120



Khơng có hoạt

tính



Sau khi qua cột lọc gel, dịch enzyme từ ml 25- 60 được thu lại sau đó

cho qua cột trao đổi ion DEAE cellulose mà khơng cần đổi đệm bởi vì đệm A

sử dụng cho sắc ký trao đổi ion được dùng cùng đệm khi chạy qua cột lọc gel.



Vùng có hoạt

tính protease



Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn protein protease từ lá cây Xuân Hoa sau khi qua

cột trao đổi ion DEAE - cellulose. Tốc độ dòng chảy 1ml/ phút, phân đoạn

được thu 3 ml/ phân đoạn.

Kết quả làm sạch trên cột trao đổi ion cho thấy protein không thấy xuất

hiện ở phân đoạn đưa mẫu vào và phân đoạn rửa, điều này chứng tỏ protein

Hoàng Thị Trang



30



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



được hấp phụ hoàn toàn vào cột trao đổi ion và protein không bị rửa trôi bởi

đệm A (hình 3.3.). Protein được thơi ra khỏi cột khi được đẩy bằng đệm A

với nồng độ NaCl từ 0,1-0,4 M. Ở nồng độ NaCl 0,1M, phần lớn protein có

hoạt tính protease được đẩy ra khỏi cột ở phân đoạn 3 và 4 (đỉnh 1) chiếm

khoảng 90% hoạt tính, một phần protease được đẩy ra ở nồng độ 0,2M NaCl

phân đoạn 5-6 (đỉnh 2) chiếm khoảng 10% hoạt tính. Ở nồng độ NaCl 0,3, 0,4

và 1M cũng thấy có xuất hiện băng protein được đẩy ra nhưng khi kiểm tra

hoạt tính protease thì khơng thấy có hoạt tính protease ở các phân đoạn này

(hình 3.3 và bảng 3.2). Điều này chứng tỏ protease được đẩy ra ở nồng độ

muối 0,1 và 0,2M.

Bảng 3.2. Kiểm tra hoạt tính protease của từng phân đoạn qua cột DEAE

-cellulose

Nồng độ NaCl



Phân đoạn



Thứ tự ml



(M)



Hoạt tính

protease (OD

750nm)



0.0



1



1-3



0.0



0.0



2



3-6



0.0



0.1



3



6-9



0.98



0.1



4



9-12



0.43



0.2



5



12-15



0.528



0.2



6



15-18



0.14



0.3



7



18-21



0.0



0.3



8



21-24



0.0



0.4



9



24-27



0.0



0.4



10



27-30



0.0



1.0



11



30-33



0.0



Hồng Thị Trang



31



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa

Tổng

Bƣớc tinh sạch



protein

(mg)



Hoạt độ

Tổng hoạt tính



riêng



(unit)



(unit/mg

protein)



Số lần

tinh

sạch



1. Dịch chiết



236.25



50.4



0.213



1



2.Tủa ethanol



72



31



0.43



2



3. Ca3(PO4)2



44



26



0.59



2.76



22



18.4



0.83



3.9



2.04



5.2



2.55



11.97



4.Sephadex

G100

5.DEAEcellulose



3.2. Điện di biến tính và khơng biến tính protein.

Để kiểm tra xem độ tinh sạch của protease thu được sau khi làm sạch,

các phân đoạn có hoạt tính protease được phân tách trên điện di SDS-PAGE.

Kết quả hình 3.4 cho thấy các mẫu phân đoạn 3-4 (đỉnh 1) chỉ xuất hiện 1

băng protein đậm kích thước khoảng 85 kDa. Ỏ phân đoạn 5-6 (đỉnh 2) cũng

xuất hiện 1 băng protein kích thước 85 kDa (dạng vết mờ) và 1 băng protein

kích thước khoảng 40 kDa, điều này chứng tỏ mẫu thu được ở đỉnh 1 (phân

đoạn 3-4) có độ tinh sạch cao còn mẫu thu ở đỉnh 2 (phân đoạn 5-6) có độ

tinh sạch thấp hơn, có lẫn protein khác và hàm hoạt tính protease rất ít so với

đỉnh 1. Điều này cũng được thấy trên mẫu điện di không biến tính nhưng kích

thước protein thay đổi do ở trạng thái khơng biến tính protein có cấu trúc tự

nhiên, vì vậy khi chạy trên điện di khơng thể hiện đúng kích thước của chúng.

Khi ép gel có chứa 0,5% casein để phát hiện băng hoạt tính protease cho thấy

các băng protein này chính là protease (hình 3.5.).



Hồng Thị Trang



32



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Hình 3.4. Điện di protein các phân đoạn sau khi qua cột sắc kí trao đổi ion

DEAE-cellulose trên gel polyacrylamid 12%. Đường chạy 1-4: mẫu biến

tính: 1:dịch qua Ca3(PO4)2, 2:dịch qua DEAE (phân đoạn 3+4), 3: dịch qua

DEAE (phân đoạn 5+6), 4: BSA; Đường chạy 5-7: mẫu khơng biến tính: 5:dịch

qua Ca3(PO4)2, 6:dịch qua DEAE (phân đoạn 3+4), 7:dịch qua DEAE (phân

đoạn 5+6), M: Marker protein (Thermo scientific).



Hình 3.5. Phát hiện băng hoạt tính protease từ các phân đoạn sau khi qua

cột sắc kí trao đổi ion DEAE-cellulose trên gel polyacrylamid 12.5%.

A: gel hiện hoạt tính protease, B: gel nhuộm Coomassie Brilliant Blue.

1: dịch qua Ca3(PO4)2; 2: dịch qua DEAE (phân đoạn 3+4); 3: dịch qua DEAE

(phân đoạn 5+6) M: Marker protein (Thermo scientific).



Hồng Thị Trang



33



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Trong khuôn khổ của luận văn này chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu

protease ở đỉnh 1. Để có thể khẳng định protease ở đỉnh 2 là cùng loại

protease, ở dạng isozymes, hay khác loại protease ở đỉnh 1 chúng tôi sẽ tiếp

tục nghiên cứu trong thời gian tới.

3.3. Ảnh hƣởng của một số chất ức chế đặc hiệu protease

3.3.1 Ảnh hưởng của PMSF lên hoạt tính protease



Hình 3.6. Ảnh hƣởng của PMSF lên hoạt tính protease

Kết quả hình 3.6 cho thấy, PMSF với nồng độ 10mM đã có tác dụng

ức chế hoạt tính của protease từ lá Xuân Hoa P. palatiferum và với nồng độ

20mM đã ức chế mạnh nhất, gần 90% hoạt tính protease.

3.3.2. Ảnh hưởng của PCMB lên hoạt tính protease



Hình 3.7. Ảnh hƣởng của PCMB lên hoạt tính protease

Hồng Thị Trang



34



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Từ hình 3.7 cho thấy PCMB ức chế khơng đáng kể hoạt tính của

protease tinh sạch. Với nồng độ 5mM chỉ ức chế khoảng 20% hoạt tính

protease.

3.3.3 Ảnh hưởng của HgCl₂ lên hoạt tính protease



Hình 3.8. Ảnh hƣởng của HgCl₂ lên hoạt tính protease

Kết quả hình 3.8 cho thấy HgCl2 với nồng độ 0,1 mM cũng chỉ ức chế

khoảng 25% hoạt tính của protease tinh sạch.

3.3.4. Ảnh hưởng của O-phenanthroline lên hoạt tính protease



Hình 3.9. Ảnh hƣởng của o-phenanthroline lên hoạt tính protease



Hồng Thị Trang



35



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Kết quả hình 3.9 cho thấy o-phenanthroline khơng có ảnh hưởng đến hoạt

tính protease.

Qua các kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi nhận thấy protease đã bị

ức chế mạnh gần 90% hoạt tính protease bởi PMSF (chất ức chế đặc hiệu

nhóm serine protease), bị ức chế nhẹ khoảng 20-25% các chất ức chế (PCMB

và HgCl2) (các chất ức chế đặc hiệu cho nhóm cysteine protease) và khơng bị

ức chế bởi o-phenanthroline (chất ức chế đặc hiệu cho nhóm protease kim

loại). Như vậy có thể kết luận protease tinh sạch từ cây P. palatiferum thuộc

nhóm protease serine.

3.4. Khả năng thủy phân của protease trên các cơ chất khác nhau

Bảng 3.4 cho thấy protease P. palatiferum đã chỉ ra có khả năng thủy

phân các cơ chất casein, bovine serum albumin, gelatin and fibrinogen.

Protease của cây Xuân Hoa P. palatiferum không thủy phân BAPNA, một cơ

chất đặc hiệu cho trypsin, do đó có thể thấy tính chất khác với các enzyme

tương tự trysin (Souza, 2007). Protease này có khả năng thủy phân fibrinogen.

Với việc xác định protease này thuộc nhóm serine protease chúng tơi nhận

thấy enzyme này có khả năng tiêu các sợi fibrin như một số serine protease

khác (Paik, 2007; Kim, 1996)

Bảng 3.4. Hoạt tính của protease P. palatiferum trên các cơ chất khác nhau

Cơ chất

Casein

BAPNA

Gelatin

BSA

Human fibrinogen



Hồng Thị Trang



Hoạt tính của protease P.

palatiferum



Đặc tính

Cơ chất chung cho

nhiều loại protease

Cơ chất của cathepsin

H/trypsin

Cơ chất chung cho

nhiều loại protease

Cơ chất chung cho

nhiều loại protease

Thrombin-serine

protease



36





Khơng có









Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi mới bước đầu khảo sát khả

năng thủy phân của protease tinh sạch trên một số cơ chất khác nhau. Để so

sánh, đánh giá một cách chính xác hoạt độ của protease trên từng cơ chất cần

có thời gian tối ưu các điều kiện hoạt động của enzyme trên từng cơ chất.

Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong thời gian tới.

3.5.



Độ bền của protease



Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tơi đã xác định được protease này

có các điều kiện tối ưu cho hoạt động (nhiệt độ: 70°C và pH: pH 7,0). Trong

luận văn này, chúng tôi đánh giá tính bền nhiệt, pH và ảnh hưởng của các ion

kim loại lên hoạt tính protease tinh sạch từ cây Xuân Hoa P. palatiferum.

3.5.1. Độ bền với nhiệt

Tính bền nhiệt rất quan trọng cho việc ứng dụng enzyme trong

công nghiệp. Để nghiên cứu tính bền nhiệt của protease lá Xuân Hoa P.

palatiferum, dịch enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-100°C trong

15 phút, sau đó được đo hoạt tính.



Hình 3.10. Độ bền nhiệt của protease



Hồng Thị Trang



37



Lớp 13 - 01 K20



Khóa luận tốt nghiệp



Viện Đại học Mở Hà Nội



Kết quả hình 3.10 cho thấy protease của lá Xuân Hoa có độ bền nhiệt

cao ở dải nhiệt độ 30-80°C, hoạt tính protease khá ổn định hầu như khơng

giảm đáng kể so với dịch enzyme ban đầu. Khi ủ dịch enzyme ở 90°C trong

10 phút protease gần như bị biến tính hồn tồn, hoạt tính protease giảm

mạnh chỉ còn khoảng 5% so với hoạt tính enzyme khơng xử lý nhiệt độ.

Enzyme này có thể thích hợp cho những ứng dụng trong việc sản xuất quy mô

lớn trong công nghiệp và Y học.

3.5.2. Độ bền với pH

pH môi trường phản ứng là một yếu tố ảnh hưởng lớn tới độ bền của

enzyme. Chúng tơi đánh giá tính bền của protease này trong khoảng từ pH 212. Ở vùng pH acid 2-3, protease mất hoạt tính hồn tồn. Khi ủ protease ở

pH 4-5 hoạt tính protease vẫn còn khoảng 55-60%. Protease bền ở vùng pH 711, protease tinh sạch từ lá Xuân Hoa P. palatiferum có độ bền cao trong mơi

trường pH kiềm, ( hình 3.11).



Hình 3.11. Độ bền với pH của protease



Hoàng Thị Trang



38



Lớp 13 - 01 K20



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×