Tải bản đầy đủ - 0 (trang)
3 Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia

3 Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia

Tải bản đầy đủ - 0trang

biệt là tinh nguyên bào loại A. Quá trình được tiến hành như sau: Chuột Wistar 9

ngày tuổi, trọng lượng cơ thể từ 18-20g được chọn để lấy tinh hoàn. Tinh hồn

được lấy và đặt trong mơi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung

glutamine (2nM), HEPES (15mM), một số amino acid, penicillin (100IU/ml),

streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml). Sau khi loại bỏ màng trắng

của tinh hồn, mơ tinh hồn được đưa vào dung dịch ni cấy có khoảng 0,05%

collagenase và dispase và 0,04mg/ml DNase, toàn bộ sản phẩm được đặt trong tủ

ấm, ở nhiệt độ 320C. Sau 10 phút các thành phần như mô liên kết được loại bỏ.

Sản phẩm lại tiếp tục được để trong tủ ấm trong 15 phút nhằm tách các tế bào

khỏi màng đáy. Sản phẩm lại tiếp tục cho vào môi trường nuôi cấy trong 20 phút,

có 0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase

IV. Sản phẩm thu được lại được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau đó

là 50mm. Sau khi rửa 2 lần, ly tâm 800 vòng/phút trong 30 phút, sản phẩm thu

được là các tế bào dòng tinh. Tác giả đã nuôi cấy các tế bào ở 32 0C, nồng độ CO2

là 5%.

- Hamra và cs, 2008 tiến hành phân lập các tế bào dòng tinh dựa vào nguyên

tắc: các tế bào thân ở tinh hoàn sẽ gắn chặt với nền collagen trong môi trường nuôi

cấy. Trong khi đó, các tế bào dòng tinh, trong mơi trường ni cấy lại khơng có đặc

tính đó.

* Ni cấy tế bào dòng tinh

- Các nghiên cứu ni cấy các tế bào dòng tinh đã có từ rất lâu, Steinberger,

1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 là những tác giả đầu tiên tiến

hành ni cấy các tế bào dòng tinh.

- Tuy vậy, ni cấy các tế bào dòng tinh chỉ thực sự có ý nghĩa từ sau những

năm 1990, khi kỹ thuật vi thao tác được áp dụng.

- Ngày nay nuôi cấy tế bào dòng tinh với 2 mục đích:







Biệt hóa các tế bào dòng tinh

Lựa chọn các tế bào khỏe mạnh



+ Đối với azoospermia không do tắc:

- Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 và Sousa, 2002,

nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ TESE và nhận thấy: sau 24h ni cấy

trong mơi trường có FSH thì tỷ lệ di động và khả năng thụ tinh của tinh trùng tăng

lên.

17



- Aslam và Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 đã ni cấy các tinh

tử của người có q trình sinh tinh bình thường. Kết quả các tinh tử phát triển

nhanh với các biểu hiện: nhân tụ đặc lại, đi hình thành và phát triển.

- Terarik, 1998 nhận thấy sự có mặt của FSH và testosterone trong mơi

trường ni cấy sẽ làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa.

- Các nghiên cứu của Tesarik vào năm 1999 và 2000 cũng thu được kết quả

tương tự ở bệnh nhân azoospermia không do tắc.

- Năm 1999, đứa trẻ đầu tiên ra đời từ tinh tử ni cấy (Tesarik).

- Cho đến nay, có nhiều phương pháp ni cấy các tế bào dòng tinh khác

nhau. Tesarik, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh cùng với các tế bào

Sertoli, trong điều kiện nhiệt độ từ 30-32 0C, cùng với các chất khác như FSH, LH.

Sousa, 2006 tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh sau khi phân lập và chọn lựa

dựa vào kỹ thuật vi thao tác. Một số các tác giả khác ni cấy các tế bào dòng tinh

cùng với tế bào Vero.

- Huleihel và cs, 2007 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào cùng với tế bào

Sertoli, dung dịch ni cấy. Mơi trường ni cấy ngồi các nội tiết tố còn bổ sung

các chất như GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell

factor), LIF (leukemia inhibitory factor). Kết quả nghiên cứu cho thấy các tế bào

phân chia tốt.

- Perrard và cs, 2007 đã tiến tới nuôi cấy các tế bào dòng tinh. Kết quả

nghiên cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực tiếp đến

lần thứ 2 của phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử tròn. Chính vì vậy các tác

giả nhận thấy số lượng tinh tử tròn tăng nhanh trong q trình ni cấy.

- Zhang, 2008 đã tiến hành ni cấy các tinh nguyên bào của chuột trên nền

các tế bào Sertoli. Sau 4 đến 5 ngày nuôi cấy, môi trường ni cấy được thay. Kết

quả thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy đã phát hiện sự phân chia tế bào. Q

trình ni cấy được kéo dài trên 50 ngày.

- Mito Kanatsu và cs, 2008 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào của chuột

Hamster trong thời gian kéo dài. Các tinh nguyên bào sau khi được phân lập và

ni cấy trong mơi trường có NGF, kết quả của nghiên cứu thu được tinh tử tròn.



18



- Gần đây một số tác giả đã tiến hành nghiên cứu biệt hố các tế bào mầm

gốc phơi thành nỗn và tinh trùng như Lacham-Kaplan, 2008. Các tác giả này đã

thu được một số thành cơng, tuy nhiên vẫn còn nhiều tồn tại cần nghiên cứu.

+ Đối với azoospermia do tắc:

- Các bệnh nhân nhóm này có q trình sinh tinh xảy ra bình thường. Thơng

thường, các bệnh nhân này có kích thước tinh hoàn, nồng độ FSH, LH và

testosterone trong máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ. Đặc biệt, chúng ta

có thể thu được tinh trùng và tinh tử trưởng thành tại mào tinh qua các kỹ thuật

PESA, MESA (Silber, 1994).

- Tuy vậy, các tế bào dòng tinh thu được tại đây thường chưa trưởng thành

hoàn toàn, hơn nữa lại khó xác định được tế bào sống để lựa chọn. Một số tác giả

đã tiến hành nuôi cấy các tế bào này và đạt được kết quả tốt đẹp như: tế bào biệt

hóa, trưởng thành hơn, khả năng xác định tế bào sống cao và tỷ lệ thụ tinh sau ICSI

tăng đáng kể (Balaban, 1999).

* Đặc điểm của các tế bào thu từ tinh hoàn bệnh nhân azoospermia:

- Tinh trùng thường chưa biệt hóa hồn tồn và khơng di động nên rất khó

xác định tinh trùng sống trong việc chọn tinh trùng để làm ICSI.

- Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ

đứt gãy ADN trong các tinh tử thu từ tinh hoàn, đặc biệt là tinh tử tròn (round

spermatid) là rất cao, đây là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công.

- Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh của tinh tử rất thấp (Tesarik):

Sự chưa hoàn thiện của trung thể

 Sự chuyển tiếp các protein nhân (từ histone thành protamine) chưa

hoàn toàn: thiếu hụt protamine sẽ cản trở sự hình thành các tiền nhân.

 Sự thiếu hụt các chất kích hoạt nỗn.





Khơng có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm một tỷ lệ đáng kể

trong các nguyên nhân vô sinh nam và đây là nguyên nhân đáng quan tâm nhất.

Nhóm azoospermia do tắc, các bệnh nhân này sẽ được điều trị bằng phương pháp

PESA-ICSI hay MESA-ICSI. Nhóm thứ 2 là nhóm azoospermia khơng do tắc, các

bệnh nhân này cho đến nay khó có khả năng điều trị. TESE-ICSI hoặc xin tinh

trùng là hướng giải quyết cho các bệnh nhân nhóm này.



19



Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc, hướng giải quyết hiện nay

vẫn là xin tinh trùng, đây vẫn là một giải pháp tình thế.

Chính vì vậy ni cấy tinh trùng, tinh tử và các tế bào gốc sinh

tinh có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh và mang lại cơ

hội làm cha cho những bệnh nhân azoospermia.

3.4 Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mơ từ cuống dốn của người

3.4.1 .Thu nhận máu cuống rốn

Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV,

HBV,

HCV…ở Bệnh viện Hùng Vương Thành phố Hồ Chí Minh.

Sau khi thai nhi vừa được sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng và cắt

trên vị trí kẹp 1 cm. Dùng kim tiêm của túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đơng

máu) đưa vào cuống rốn ở vị trí gần nhau thai. Máu cuống rốn sẽ theo kim và ống

dẫn chảy vào túi thu máu. Khi máu hết chảy, rút kim ra và mang túi chứa máu về

phòng thí nghiệm (được bảo quản lạnh trong đá gel).

Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ.

3.4.2 .Giai đoạn 1, nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: chọn lọc MSC

Về nguyên tắc, máu trong cuống rốn ln chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo

máu

(Hemapoietic Stem Cell_HSC), tế bào máu trưởng thành và MSC. Các MSC và tế

bào gốc tạo máu thuộc quần thể các tế bào đơn nhân. Tiến hành thu nhận quần thể

tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque

(Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa

các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên. Trong

quá trình li tâm, các tế bào đã biệt hóa với kích thước lớn hơn sẽ đi xuyên qua lớp

Ficoll và lắng ở đáy ống li tâm. Các tế bào hồng cầu không nhân nhẹ, nằm trong

lớp huyết tương bên trên. Và các tế bào đơn nhân với kích thước trung bình ln

nằm ở lớp giữa. MSC sẽ được tách khỏi tế bào gốc tạo máu trong quần thể tế bào

đơn nhân bằng phương pháp nuôi cấy. Trong ni cấy, các MSC sẽ bám dính vào

bề mặt (giá thể) ni cấy, trong khi đó tế bào gốc tạo máu khơng có khả năng này.

Tế bào đơn nhân sau khi thu nhận được huyền phù trong môi trường ni cấy

IMDM, 10% FBS, ni trong bình ni cấy (Nunc, 25 cm2) sao cho đạt mật độ

3.105 tế bào/cm2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ, các MSC bắt đầu bám

trên bề mặt đáy của bình ni, thay môi trường để loại bỏ hết các tế bào không

bám (các tế bào chết và tế bào gốc tạo máu), tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào mọc

đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình ni, với chế độ thay môi trường là 7 ngày/lần.



20



3.5 Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC

Khi mật độ MSC trong bình ni tăng, đạt khoảng 70-80% tỷ lệ diện tích đáy bình,

tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp khơng gian và chất dinh dưỡng cho MSC.

Quy trình được tiến hành như sau: loại bỏ môi trường cũ và rửa tế bào với 4-5 ml

PBSA có bổ sung gentamycin (10 μg/ml) hai lần. Tiếp tục loại bỏ dịch rửa và bổ

sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05%. Sau 15 giây, tiến hành đổ bỏ dung dịch enzyme

nhưng vẫn giữ lại khoảng 1 ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ 2-3 phút. Sau đó,

lắc nhẹ bình ni cấy để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Khi tế bào co tròn và tách

ra khỏi bề mặt bình ni, phải trung hòa trypsin thừa bằng 10-11 ml mơi trường

IMDM 10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình ni mới.

3.6.Biệt hố MSC

Các MSC được thu nhận theo phương pháp trên, sau khi cấy chuyền từ 5-7 lần,

tiến hành

kiểm tra độ tinh sạch, tạo nồng độ thích hợp để cuối cùng sử dụng cho biệt hóa in

vitro.

3.7 .Biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ (adipocyte)

Để biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, các MSC có nồng độ chuẩn được ni trong mơi

trường IMDM 10% FBS có bổ sung 1 μM dexamethasone, 200 μM indomethacin,

1,7 μM insuline, 500 μM isobutyl-methylxanthine (IBMX) (Sigma). Trong đó,

dexamethasone là một glucocorticoid steroid có tác dụng cảm ứng cho sự biệt hóa

và các yếu tố bổ sung còn lại sẽ kích thích sự biệt hóa. Insuline sẽ kích thích sự thu

nhận các phân tử glucose vào tế bào, tạo nguyên liệu cho các phản ứng chuyển hóa

thành các giọt mỡ [10;11]. IBMX là chất ức chế phosphodiesterase làm khóa sự

chuyển cAMP thành 5’AMP [8]. Điều này gây nên sự điều hòa dương tính

hormone nhạy cảm lipase (HSL). HSL sẽ chuyển triacyl glyceride thành glycerol

và acid béo tự do, đây chính là quá trình tạo mỡ [8]. Indomethacin là ligand của

PPAR (peroxisome proliferators-activated receptor) làm hoạt hóa một nhân tố

phiên mã ức chế tín hiệu Wnt, cần thiết cho sự biệt hóa thành mỡ [8;13].

Sự biệt hóa được ghi nhận khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40

thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ. Các tế bào tạo mỡ còn được xác định dựa

vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil red (Merck). Oil red là thuốc nhuộm

lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid và tạo màu đỏ.

3.8 Biệt hoá MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast)

Các MSC có nồng độ chuẩn được ni trong mơi trường IMDM 10% FBS có bổ

sung 100 nM dexamethasone, 50 μg/ml L-ascorbic acid 2-phosphat (AsAP) và 100

mM β- glycerolphosphate (Sigma). Dexamethasone có khả năng hoặc kích thích

hoặc ức chế sự biệt hóa thành xương phụ thuộc vào nồng độ của nó. Nồng độ cao

21



của dexamethasone sẽ cảm ứng biệt hóa thành mỡ, trong khi đó, với nồng độ thấp

hơn, chất này sẽ kích thích MSC biệt hóa thành xương .AsAP làm dễ dàng q

trình biệt hóa thành xương, bao gồm kích thích sự tổng hợp collagen, ngồi ra nó

còn có tác động tăng sinh tế bào [5;6;9]. Cuối cùng, β-glycerolphosphate là yếu tố

quan trọng kích thích sự hình thành chất nền được khống hóa khi kết hợp với

dexamethasone và AsAP [9].

Sau 7-14 ngày ni cấy, sự biệt hố được đánh giá thơng qua khả năng tích tụ của

calcium trong chất nền nhờ phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red

(Sigma).

IV kết luận

Việc nghiên cứu tế bào gốc hứa hẹn nhiều thành công với những ứng dụng lớn đối

với con người tuy nhiên vẫn còn tồn tại rất nhiều khó khăn trong nghiên cứu.

Về mặt xã hội việc nghiên cứ tế bào gốc còn chịu sự chi phối của vấn đề đạo đức

xã hội,người ta không chấp nhận các nhà khoa học lấy tế bào gốc từ phơi người vì

đó là một sinh mạng chưa tượng hình.

Tuy vậy điều quan trọng ở đây là việc nhận diện và biệt lập tế bào gốc cần rất

nhiều nghiên cứu chưa kể đến việc tạo mơi trường biệt hố, cấy ghép là một điều

vơ cùng khó khăn.cơ thể chúng ta có cơ chế đào thải những vật chất di truyền lạ

vào cơ thể vì vậy khi cấy ghép tế bào hay cơ quan điều gặp trở ngại trong việc giữ

cho nó hoạt động được trong cơ thể sinh vật được cấy ghép.

Nhưng nhìn chung việc nghiên cứu tế bào gốc chỉ bước đầu phát triển, thanh tựu

không nhiều nhưng tiêm năng của các nghiên cứu này có hy vọng rất lớn giúp giải

quyết các vấn đề nan giải trong lĩnh vực y học và có thể ở nhiều lĩnh vực khác

trong tương lai.



22



Tài liệu tham khảo

























Sách:công nghệ sinh học – pgs.ts Nguyễn Bá Lộc

http://www.khoahoc.com.vn/

http://giaoan.violet.vn/

sách “Công nghệ tế bào gốc”-Phan Kim Ngọc

www.nhasinhhoctre.com/

www.sinhhocvietnam.com

stemcells.nih.gov

www.medicalnewstoday.com/

www.sciencedaily.com/

topics.nytimes.com

www.cell.com/cell-stem-cell/



23



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

3 Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia

Tải bản đầy đủ ngay(0 tr)

×