Tải bản đầy đủ - 73 (trang)
Đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1.

Đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1.

Tải bản đầy đủ - 73trang

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng

(Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: a. Cành mang lá, cụm quả; b. Thân già; c. Thân non; d. Tua cuốn; e. Lá;

f. Gốc lá; g. Ngọn lá; h. Cụm quả; i. Quả; j. Quả cắt ngang; k. Hạt (mặt bụng);

l. Hạt (mặt lưng); m. Hạt cắt ngang; n. Hạt cắt dọc

3.1.2. Đặc điểm vi học

3.1.2.1.



Đặc điểm vi phẫu thân



Vi phẫu thân có thiết diện tròn. Từ ngoài vào trong gồm: biểu bì cấu tạo bởi

1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau, màng ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng (1). Tiếp

theo là mô dày tập trung thành từng đám (2) cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành dày

lên ở các góc (2). Mô mềm rất mỏng gồm các tế bào hình đa giác, hình tròn, kích

thước lớn sắp xếp lộn xộn nhau tạo thành các khoảng gian bào (3). Mô cứng gồm

các tế bào dày hóa gỗ tạo thành hình cung phía trên bó libe gỗ (4). Libe gỗ tạo thành



28



từng bó riêng biệt gồm libe ở phía ngoài (5) và gỗ ở phía trong (6) giữa các bó libe

gỗ là tia ruột. Mô mềm ruột ở trong cùng cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác kích

thước lớn, thành mỏng, xếp lộn xộn (7).



Hình 3.2: Vi phẫu thân cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: 1. Biểu bì; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Sợi; 5. Libe; 6. Gỗ;

7. Mô mềm ruột

3.1.2.2.



Đặc điểm vi phẫu lá



Gân lá: Mặt trên hơi lõm. Mặt dưới lồi thành hình cung. Từ trên xuống dưới

gồm: Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi một hàng tế bào hình tròn xếp xít

nhau, màng ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, thỉnh thoảng có lông che chở đơn bào. Mô

dày trên tập trung thành đám cấu tạo khoảng 8 hàng tế bào thành dày. Mô mềm gồm

các tế bào hình tròn, kích thước lớn, xếp lộn xộn nhau để hở các khoảng gian bào.

Libe gỗ tạo thành bó. Bó to nhất ở dưới biểu bì trên. Libe ở trên. Gỗ ở dưới. Mô dày

dưới phân bố ở toàn bộ mặt gân dưới gồm khoảng 3 hàng tế bào.



29



Phiến lá: Cấu tạo bởi biểu bì trên và biểu bì dưới. Mô giậu gồm 1 hàng tế bào

hình chữ nhật xếp sát nhau. Trong mô khuyết rải rác có các tinh thể calci oxalat

hình cầu gai.

1

2

11



3



4

5

6

10

7

8



9



Hình 3.3: Vi phẫu lá cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: 1. Biểu bì dưới; 2. Mô dày dưới; 3. Mô mềm; 4. Gỗ; 5. Libe;

6. Mô cứng; 7. Mô dày trên; 8. Biểu bì trên; 9. Mô giậu; 10. Tinh thể calci oxalat

hình cầu gai; 11. Lông che chở.

3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu

3.1.3.1.



Bột thân



Bột màu xám, không mùi, không vị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm

sau: tinh thể calci oxalat hình kim, hình cầu gai và hình khối. Hạt tinh bột hình

chuông. Sợi. Mảnh mạch xoắn và mảnh mạch điểm. Mảnh mô mềm gồm các tế bào

hình đa giác, xếp lộn xộn. Lông che chở đơn bào.



30



1



2



3



5



4



6



7



8



9



Hình 3.4: Đặc điểm bột thân cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: 1. Tinh thể calci oxalat hình kim; 2. Hạt tinh bột hình chuông; 3. Sợi;

4. Mạch xoắn; 5. Mảnh mô mềm; 6. Lông che chở đơn bào; 7. Tinh thể calci oxalat

hình cầu gai; 8. Mạch điểm; 9. Tinh thể calci oxalat hình khối.

3.1.3.2.



Bột lá



Bột màu xám, không mùi, không vị. Soi bột trên kính hiển vi có các đặc

điểm sau: Tinh thể calci oxalat hình kim và hình cầu gai riêng lẻ hoặc tập trung

thành đám. Mảnh mạch xoắn và mạch điểm. Hạt tinh bột đơn, hình tròn. Lông che

chở đơn bào.



31



1a



3a



1b



2



3b



4



6



5



7



Hình 3.5: Đặc điểm bột lá cây Nho rừng ( Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: 1a,1b. Tinh thể calci oxalat hình kim; 2. Mạch xoắn; 3a, 3b. Mạch điểm;

4. Hạt tinh bột; 5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 6. Mảnh mạch;

7. Lông che chở.

3.2.



Nghiên cứu về hóa học



3.2.1. Chiết xuất

1,5 kg nho rừng được chiết nóng bằng dung môi ethanol (EtOH) tuyệt đối

(3h/lần x 3 lần x 12 lit) ở nhiệt độ từ 50-60°C. Lọc, thu hồi dưới áp suất giảm thu

được 68,11 g cao EtOH. Hòa tan cao ethanol trong nước nóng (tỉ lệ 1:1), chiết lỏnglỏng lần lượt với các với các dung môi n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc). Gộp

dịch chiết từng phân đoạn và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 7,83

g cao n-hexan (11,50%, VHH); 39,16 g cao EtOAc (57,50%, VHE); 13,43 g cao

nước (19,71%, VHW).



32



Dược liệu khô (1,5 kg)

Chiết nóng với ethanol

(3h/3Lx12lit), t° (50-60°C).

Lọc, cất thu hồi dung môi

Cao ethanol (68,11 g)

Nước cất

Dịch chiết nước

n-hexan



Dịch chiết nước



Dịch chiết n-hexan

n-hexan thu hồi



Ethyl acetat



Cắn n-hexan (7,83 g)



Dịch chiết ethyl

acetat



Cắn nước

(13,43 g)



Ethyl acetat thu hồi

Cắn ethyl acetat

(39,16 g)

Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất các cắn của V. heyneana Roem. & Schult.

3.2.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

Tiến hành các phản ứng định tính dược liệu, cho kết quả được tổng hợp tại

bảng 3.1 như sau:



33



Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Nho rừng

(Vitis heyneana Roem. & Schult.)

STT



1



Nhóm chất



Alkaloid



Phản ứng định tính



Kết quả



Phản ứng với TT Mayer



-



Phản ứng với TT Bouchardat



-



Phản ứng với TT Dragendroff



-



Phản ứng với TT Liebermann-



-



Kết luận



Không



Burchardat

2



3



4



5



6



7



Glycosid tim



Saponin



Flavonoid



Coumarin



Anthranoid



Tannin



Phản ứng Baljet



-



Phản ứng Legal



-



Quan sát hiện tương tạo bọt



-



Phản ứng Salkowski



-



Phản ứng phân biệt 2 loại saponin



-



Phản ứng Cyanidin



++



Phản ứng với FeCl3



++



Phản ứng với kiềm



+



Phản ứng mở đóng vòng lacton



-



Phản ứng diazo hóa



-



Phản ứng chuyển dạng cis-trans



-



Phản ứng Borntraeger



-



Phản ứng với FeCl3



++



Phản ứng với chì acetat



++



Phản ứng với gelatin



+



Phản ứng với đồng acetat



++

++



Không



Không







Không



Không







8



Acid amin



Phản ứng với ninhydrin



9



Acid hữu cơ



Phản ứng với Na2CO3



-



Không



10



Đường khử



Phản ứng với TT Fehling



+







11



Polysaccharid



Phản ứng với TT Lugol



++







34







12



Chất béo



Tạo vết mờ trên giấy



+







13



Sterol



Phản ứng với anhydrid acetic



++







14



Caroten



Phản ứng với H2SO4 đặc



Ghi chú:



(++): dương tính rõ



(-): âm tính



-



Không



(+): dương tính



Kết luận: Trong dịch chiết phần trên mặt đất của cây Nho rừng (Vitis

heyneana Roem. & Schult.) có chứa các hợp chất: flavonoid, tannin, acid amin,

đường khử, polysaccharid, chất béo và sterol.

3.2.3. Khảo sát và phân lập các hợp chất trong phân đoạn n-hexan

3.2.3.1.



Khảo sát bằng SKLM



Mục đích: khảo sát sắc ký lớp mỏng với một số hệ dung môi khác nhau để

chọn được hệ dung môi thích hợp chạy cột.

Dịch chấm sắc kí: cao n-hexan hòa tan trong methanol.

Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C/1h, để

nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.

Dung môi khai triển: tiến hành thăm dò trên 5 hệ dung môi

Hệ I: n-hexan – ethyl acetat (7:1)

Hệ II: n-hexan – aceton (10:1)

Hệ III: dichlomethan – methanol (20:1)

Hệ IV: dichlomethan – ethyl acetat (10:1)

Hệ V: dichlomethan – aceton (20:1)

Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4 10%, nhiệt độ và soi dưới đèn tử

ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.

Tiến hành: chấm dịch phân đoạn n-hexan/methanol lên bản mỏng, đặt vào

bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc

ký, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Soi để phát hiện vết dưới đèn tử ngoại và

phun thuốc thử hiện màu là H2SO4 10%/ethanol, sau đó hơ nóng trên bếp điện.

Kết quả: sau nhiều lần khai triển với 5 hệ dung môi trên thì thấy hệ I (nhexan: ethyl acetat – 7:1) cho kết quả tách tốt, nhiều vết rõ ràng, tách rời so với 4 hệ

còn lại (các vết bị kéo dài, dính nhau). Vì vậy chọn hệ I làm dung môi chạy cột.



35



1



2



3



Hình 3.7: Sắc ký đồ cao n-hexan khai triển với hệ dung môi I

Chú thích: 1: Không phun thuốc thử, UV254; 2: Không phun thuốc thử, UV365; 3:

Phun thuốc thử, t° (thuốc thử là H2SO410%/ethanol).

3.2.3.2.



Phân lập chất trong cao n-hexan bằng phương pháp sắc ký cột



Mẫu: 7,5 g cao n-hexan được tẩm với 10 g Silicagel 60 (0,040-0.063 mm).

Cao n-hexan đươc hòa tan trong một lượng vừa đủ dichlomethan, trộn dung dịch

thu được với Silicagel 60 sau đó để bay hơi hết dung môi thu được bột mịn.

Cột: dùng cột thủy tinh dài 50 cm, đường kính 5 cm, có lót một miếng bông

nhỏ dưới đáy cột.

Chất nhồi cột: Silicagel 60 (0,040-0.063 mm) (Merck). Silicagel được ngâm

trong một lượng vừa đủ n-hexan, khuấy đều, đuổi hết bọt khí.

Nhồi cột (Phương pháp nhồi cột ướt): hỗn dịch Silicagel đã được chuẩn bị ở

trên được đổ từ từ vào cột thủy tinh, vừa đổ vừa mở khóa cột tối đa, để cho Silicagel

nén đều (gõ nhẹ lên thành cột). Sau khi đưa hết Silicagel lên cột, cho dung môi chảy

qua cột trong khoảng 2,5 h để ổn định cột.

Nạp mẫu (phương pháp nạp mẫu khô): sau khi ổn định cột, bề mặt dung môi

cách bề mặt Silicagel khoảng 5 cm thì cho từ từ mẫu lên cột. Dùng một miếng bông

để bảo vệ mặt cột.



36



Dung môi khai triển: n-hexan: ethyl acetat lần lượt với các tỷ lệ: 100:0; 50:1;

20:1; 10:1; 5:1; 2:1; 1:1; 1:2; 0:100.

Chạy sắc kí: Tiến hành rửa giải với hệ dung môi đã chọn, tốc độ rửa giải 30

giọt/phút, thu dịch rửa giải vào các ống nghiệm dung tích 20 ml.

Khảo sát các phân đoạn thu được bằng SKLM (với các hệ dung môi n-hexan:

ethyl acetat; DCM: methanol), gộp các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau, cất loại

bỏ dung môi dưới áp suất giảm để thu được các nhóm phân đoạn.

Phát hiện vết: quan sát bản mỏng dưới đèn UV 254 nm và 365 nm, hiện màu

bằng thuốc thử H2SO4 10%/ ethanol, t°.

Tinh chế các chất phân lập được bằng cách xử lí loại tạp, chất màu, kết tinh

lại bằng dung môi thích hợp. Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng

SKLM với các hệ dung môi khác nhau.

Kết quả: thu được 7 phân đoạn, kí hiệu VHH1→VHH7, kiểm tra các phân

đoạn lại bằng SKLM.

Phân đoạn VHH3 có kết tinh mầu trắng. Rửa bằng aceton thu được kí hiệu là

VH01 (200mg).

Phân đoạn VHH4 có kết tinh màu trắng. Rửa kết tinh thu được nhiều lần

bằng aceton thu được chất sạch, kí hiệu là VHD (121mg).



37



Hình 3.8: Hình ảnh các

chất phân lập được từ cao

n-hexan

1. Hình ảnh chất VH01

Sắc ký đồ chất:

2. Không phun thuốc thử,

UV254.

1



2



3



4



3. Không phun thuốc thử,



Chất VH01



UV365

4. Phun thuốc thử, t°

5. VHD, Daucosterol

Hệ 1: DCM: MeOH (10:1)

Hệ 2: n-hexan:EtOAc (1:10)

Hệ 3: n-hexan: aceton (1:5)

(thuốc thử là H2SO410%/

ethanol)



4



5

Chất VHD



3.2.3.3.



Biện giải cấu trúc các hợp chất phân lập được



 Hợp chất VHD

Tính chất: Dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 285oC,

tan trong chloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ UV. Trên sắc ký

bản mỏng, sau khi nhúng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng trên

bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng đỏ. Dựa vào các đặc trưng hóa lý kết hợp

chấm sắc ký đối chứng 3 hệ dung môi dicloromethan: methanol (10:1), hệ n-hexan:

ethylacetat (1:10), hệ n-hexan: aceton (1:5) thì hợp chất VHD được xác định là

daucosterol.



38



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1.

Tải bản đầy đủ ngay(73 tr)

×